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《泰山医学院》 2005年
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饮酒对高脂饮食家兔颈动脉粥样硬化形成的实验研究

刘力峰  
【摘要】:目的:建立家兔颈动脉粥样硬化模型,探讨单纯大量饮酒、高脂饮食伴不同剂量饮酒对家兔颈动脉粥样硬化(CAS)发生和发展的影响,并对其延缓或加速CAS的具体机制与家兔血脂的动态变化、颈动脉血管重塑指标、颈动脉粥样斑块内MMP-2表达的关系作深入探讨。 材料与方法: 1.动物分组与饲养: 本实验采用健康雄性新西兰白兔,月龄3-4个月,体重2.00±0.15kg。将60只家兔随机分为六个组,每组10只,即:(A)对照组,饲以普通颗粒饲料;(B)模型组,饲以高脂饲料;(C)饮酒组,白酒1.5 g/kg·d;(D)模型+小剂量饮酒组(白酒0.3g/kg·d);(E)模型+中剂量饮酒组(白酒0.6g/kg-d);(F)模型+大剂量饮酒组(白酒1.5g/kg·d)。 各高脂饮食组给予高脂饲料(配方:1%胆固醇,7.5%蛋黄粉,3%猪油,88.5%基础饲料);各饮酒组采用山东临清酒厂生产的38°百年卫河白酒,以灌胃方式饮入。饮用酒精量从低到高依次为0.3g/kg-d、0.6 g/kg-d.1.5g/kg-d。每兔每日进食量为120g、单笼喂养、饮水不限,各组家兔于12w末处死。 2.血脂及血糖的测定: 各组家兔于高脂饲养前(0周)及4周、8周、12周末,取禁饮食12小时兔耳源静脉血2ml,静止30min后离心取血清,测血清胆固醇(TCH),甘油三脂(TG),高密度脂蛋白(HDL),低密度脂蛋白(LDL)及血糖(GLU)。 3.血管重塑指标的测定 于12周末处死家兔,在距颈动脉分叉处1mm的近心端离断,将切面包埋,取5μm切片,行HE染色,光镜下观察血管的形态学改变。并应用Image-Pro-Plus 4.0图像分析系统测定以下血管重塑(Vascular remodeling, VR)指标:内弹性膜周长、外弹性膜周长、斑块面积(plaque area, PA)、内弹性膜包围面积(internal elastic laminal area, IELA)、外弹性膜包围面积(external elastic laminal area, EELA)、中膜面积(medial area, MA)和管腔面积(lumen area, LA)、并计算PA/IELA代表血管狭窄程度。 4.MMP-2表达及光密度分析 取4μm石蜡切片,应用免疫组织化学法检测颈动脉粥样斑块内MMP-2的表达,以斑块内出现棕黄色颗粒为MMP-2阳性表达。每组随机选取8个典型切片,每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400)。应用Image-Pro-Plus 4.0图像分析系统,测定每个视野下斑块内阳性反应的平均光密度值。 5.统计学处理 全部数据采用SAS6.12统计软件进行统计分析,以P0.05认为差异有统计学意义。 结果: 1.血脂各指标的结果 TCH:A, C两组无差别,各模型组(B、D、E、F组)4周末明显增高,8周末稍稍降低,12周末达高峰,与A组相比差异有统计学意义;12周末E组数据最小为35.10±3.06mmol/L,与B组相比P=0.0137,但D、F饮酒组与B组相比无差别。 TG:4周末之前,任意两组未显示出差别,B、D、E、F组随时间呈逐渐增高趋势,于8周及12周末时,E组家兔均显示相对其他饮酒组较小的数值(1.44±0.42和1.56±0.66mmol/L,且与同期B组相比,P值分别=0.0103、0.0145)。 HDL:D组家兔于4周末即升至高峰,之后逐渐下降;E组于8周末升高至最高峰(8.21±0.60mmol/L,与B组相比P=0.008);12周末时,各高脂加饮酒组家兔血清高密度脂蛋白胆固醇均降低,但仍以E组的HDL为高(与B组比较P=0.0409),D饮酒组次之。 LDL:4周末时各模型组(B、D、E、F组)LDL水平均显著增高(P0.0001),8周末时又均显著降低(与4周末相比P0.001),至12周末再增高,但未有超过4周末时对应的各组高值;其动态变化趋势与血清总胆固醇较一致。4周末时D组升高最轻,其至8周末时下降较缓和,且在12周末时未见明显增高。终末时,小中量饮酒组家兔LDL水平较B组(12周末D、E组与B组相比:P=0.0066、0.0112)和F组为低。 2.血糖的水平 除F组在第8周末略升高(与4周末相比P=0.0023),B、C、D、E组4周及8周末时组内血糖无显著变化;12周末时除D组外,各实验组血糖增高显著。血糖和饮酒量之间存在正相关关系(R=0.61306,P=0.0024);线性回归方程为Y(血糖浓度)=7.912621+3.203883X(饮酒剂量),P=0.0044。 3.病理形态学结果 A组与C组未见动脉粥样硬化斑块形成,其他四组均可见明显的颈动脉粥样硬化斑块形成,光镜下可见部分血管管腔狭窄,斑块内平滑肌细胞、巨噬细胞聚集,中层的平滑肌细胞向内膜下迁移,并吞噬脂质形成典型的泡沫细胞。其中E组家兔颈动脉病变最轻,F组家兔颈动脉粥样硬化病变最重,有些能见到胆固醇结晶。 4.血管重塑指标结果 B组家兔内膜周长、外膜周长、IELA、EELA、MA均较正常对照组小;因又有斑块生成,LA更加变小,以上各指标与正常对照组相比P0.05。单纯饮酒组家兔颈动脉各重塑指标均和正常对照组相比差异有统计学意义(P0.05),表现为血管明显扩张(可见附图),管壁变薄。 模型加不同剂量饮酒组之间比较:E组内膜周长与D组相比、外膜周长与F组相比差异有统计学意义;IELA各饮酒组间无显著性差异,E组的EELA水平与D组相比虽有差异,但是无统计学意义(P=0.067),但与F组相比,差异有极显著统计学意义(P=0.0041)。且以E组家兔颈动脉斑块面积最小,与B组、D组、F组相比P值分别为0.0172、0.2304、0.0112。中膜面积以D组最小,F组最大,但D组与E组相比无显著差异。管腔面积以E组最小,D组最大,三饮酒组相比差异无统计学意义。血管狭窄率以B组最小,其次为E组,后者与D组相比P=0.0979,与F组相比P=0.0145。相关性分析显示:PA和LA.与IELA及EELA均呈正相关关系,其中IELA与EELA呈显著正相关,R=0.96385,P0.001。 5.免疫组化的结果 本研究发现,正常对照组家兔未见MMP-2的阳性表达。各高脂饮食组可见MMP-2在颈动脉粥样斑块内中呈阳性表达,斑块的细胞外基质中亦有大量MMP-2沉积,而中层SMC则表达微弱。F组家兔颈动脉粥样斑块内MMP-2染色强度明显高于其他各组,而E组颈动脉粥样斑块内MMP-2的表达在各组家兔中最弱。 结论: 1.应用单纯高脂饮食喂养家兔,或者在高脂饮食的基础上加以不同剂量的酒精,均能够成功制造家兔颈动脉粥样硬化模型,这些方法比人工损坏内膜造成的家兔颈动脉粥样硬化模型,更加科学、安全和准确,而且这符合动脉粥样硬化的自然。 2.单纯大量饮酒12周对于普通型食草动物家兔不能造成动脉粥样硬化,这在反面印证了无脂不成斑,说明脂质浸润对动脉粥样硬化形成的起始和进展起重要作用。适量饮酒具有抗动脉粥样硬化作用,其部分作用机制是通过升高HDL、降低TCH、TG和LDL而实现的。 3.颈动脉粥样硬化斑块容易在颈动脉分叉处发生,SMC增殖和迁移在CAS的发生和进展过程中起重要作用,巨噬细胞、淋巴细胞等亦参与了颈动脉粥样硬化的发生和发展。E组家兔斑块面积最小且仅为动脉粥样硬化的脂纹期。 4.单纯高脂饮食家兔颈动脉呈限制性重塑,单纯高剂量饮酒组家兔颈动脉呈明显扩张性改变;E组家兔斑块面积最小,内弹力膜面积和外弹力膜面积均最小,在各饮酒伴高脂摄入组家兔中,其颈动脉狭窄程度最轻;D组及F组家兔颈动脉斑块面积较大,内外弹力膜面积较E组增加明显。 5.0.6g/kg·d剂量饮酒不会明显增加MMP-2的表达,可能在延缓颈动脉粥样硬化进展中起重要保护作用。MMP-2在各饮酒组家兔中表达的差异随着饮酒量的增加亦呈现“J”形,提示饮酒致颈动脉粥样硬化机制有MMP-2参与其中。 6.适量饮酒可显著提高血浆中HDL的水平,降低TCH、LDL水平,抑制MMP-2的表达,在延缓颈动脉粥样硬化中起重要作用。
【学位授予单位】:泰山医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:R543.4

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