iNOS在肢体IR后关节损伤中的作用及组织芯片技术的初步应用

【摘要】：目的：通过观察肢体IR后关节的病理变化,检测关节各组织内iNOS的表达规律和主要细胞的凋亡情况,初步探讨肢体IR后有无关节损伤及可能的机制;同时设计、使用手工组织芯片制作技术,寻找一种经济、高效的肢体IR研究方法。 方法：健康新西兰白兔54只,随机分为9组,每组6只动物。参照M. Hatoko改良方法制作兔右后肢原位IR模型；左侧肢体实施同样的手术但不阻断血运作为自身对照。按设计时点处死动物取材。观察下述指标：关节液涂片镜检；关节各组织病理变化；免疫组化、CLSM检测iNOS的表达；TUNNEL法标记凋亡细胞；苏木素-亮绿一番红三色法检测蛋白多糖含量；免疫荧光法检测软骨中胶原的变化；制作组织芯片并进行HE、免疫组化、免疫荧光检测,与常规连续切片检测结果比较,判断组织芯片技术引入肢体IR实验研究的可行性。 1.肢体IR后关节损害表现为时间依从性进行性加重；自身对照无明显变化。 2.iNOS在关节周围肌中成时间依从性动态表达,表达量与骨骼肌细胞凋亡、变性、坏死细胞计数正相关：iNOS于IR2h在毛细血管内皮细胞表达,IR4h定位胞浆,表达增加,IR8h表达最多,达高峰,24h下降,与对照侧相比具有统计学意义(p0.01)。IR2h可见少量变性坏死细胞,IR4h、8h持续增加,24h达高峰,3d开始减少,14d可见骨骼肌萎缩,与对照组比较有统计学意义(p0.05)。iNOS与骨骼肌细胞病理变化成正相关(r=0.682,p=0.043)。 3.iNOS在半月板中成时间依从性动态表达,表达量与半月板软骨细胞凋亡数正相关：iNOS阳性细胞在IR2h增高,8h达高峰,全层表达,定位于胞浆,24h开始减少,3d后明显下降,局限在半月板的深层细胞。与对照侧比较有统计学意义(p0.05)凋亡细胞数IR2h增加,IR24h达高峰,3d后下降,7d后仍有表达,表现出持续高表达,与自身对照相比有显著统计学意义(p0.01)。iNOS在半月板中的动态表达与半月板软骨细胞凋亡正相关(r=0.754,p=0.031)。 4.iNOS在关节软骨细胞中成时间依从性动态表达,表达量与软骨细胞凋亡正相关：iNOS于IR2h增高,全层表达,8h达高峰,24h开始减少,3d后明显下降,局限在同源细胞族和增殖区。与对照侧比较有显著统计学意义(p0.01)。凋亡细胞于IR2h增加,24 h达高峰,3d稍微下降,持续到7d仍较高,表现为软骨细胞凋亡持续性异常增高。对照侧软骨细胞凋亡无明显变化,双侧比较,具有显著统计学意义(p0.01)。iNOS在关节软骨细胞中的动态表达与软骨细胞凋亡正相关(r=0.828,p=0.006)。 5.关节软骨PG的变化：IR2h、IR4h PG开始减少(AOD值),但无统计学意义。IR24h PG继续减少,染色变浅,至IR3d组降至最低,并维持在较低水平,与对照组比较有统计学意义(p0.01)。PG降至最低时只有对照组的56%。 6.关节软骨胶原II的变化：CollagenI I在IR2h、IR4h、IR8h组降低(AOD值)但无统计学意义。IR3d后明显降低,持续到14d仍无升高,与对照组比较有统计学意义(p0.05)。 7.组织芯片的应用：自行设计制作组织芯片,与常规连续切片比较检测结果无统计学意义(p0.05)。 1.肢体IR后关节损害进行性加重,存在再灌注损伤。 2.肢体IR后iNOS在关节周围肌、半月板、软骨细胞中成时间依从性动态表达,与组织细胞凋亡计数正相关。iNOS异常高表达,产生大量NO,引起细胞凋亡；胶原纤维,蛋白多糖损伤继发于细胞凋亡。iNOS的异常表达至少是肢体IR后关节损伤的主要途径之一,是软骨损伤的始动因素。 3.参照传统组织芯片制作流程,自行设计应用套针钻取、融孔植入、铝箔赋形等技术,大大简化了组织芯片制作,简单、可靠、高通量、大样本、省时快速、简便经济,易于推广,适合于相对多分组、大样本的实验研究。意义：肢体IR临床上普遍存在,但研究较少,是否存在关节IR损伤尚有争议;关节特别是关节软骨、半月板的IR机理尚无报道；多分组、多时点的肢体IR实验研究,需大量时间、人力、物力,组织芯片技术可以大幅提高效率；断指再植因关节内外粘连,功能恢复不满意,缺乏有效疗法,本实验有望为找到新的方法提供理论依据。