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《山东中医药大学》 2017年
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阿尔茨海默病同病异证tau蛋白异常磷酸化机制研究

侯江淇  
【摘要】:目的:在建立阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)肾精亏虚证、痰浊阻窍证、瘀血阻络证病证结合动物模型的基础上,通过应用蛋白免疫印迹法、免疫组织化学、免疫荧光等方法,探讨AD不同证候类型在tau蛋白异常磷酸化位点的差异及相关生物学机制,部分阐释AD同病异证在tau蛋白异常磷酸化方面的微观病理改变,为同病异证理论提供现代生物学依据。方法:1.构建AD三典型证候病证结合模型、AD疾病模型及假手术组模型。(1)AD肾精亏虚证病证结合模型的构建:该组大鼠颈背部皮下注射D-半乳糖(D-gal)持续48天,构建亚急性衰老大鼠模型,模拟肾精亏虚证;并于行为学检测前一周在大鼠大脑双侧海马CA1区注射凝聚态Aβ25-35毒性片段,复合构建AD肾精亏虚证病证结合模型(简称肾精亏虚组)。(2)AD痰浊阻窍证病证结合模型的构建:该组大鼠颈背部皮下注射D-gal持续48天,构建衰老期肾精亏虚的大鼠模型,同时给予高脂饮食喂养,于行为学检测前一周在大鼠大脑双侧海马CA1区注射凝聚态Aβ25-35毒性片段,复合构建本虚标实的AD痰浊阻窍证病证结合模型(简称痰浊阻窍组)。(3)AD瘀血阻络证病证结合模型的构建:该组大鼠颈背部皮下注射D-gal持续48天,构建衰老期肾精亏虚的大鼠模型,并予0℃冰水浴28天,于行为学检测前一周在大鼠大脑双侧海马CA1区注射凝聚态Aβ25-35毒性片段,复合构建本虚标实的AD瘀血阻络证病证结合模型(简称瘀血阻络组)。(4)AD疾病模型的构建:该组大鼠于行为学检测前一周在大鼠大脑双侧海马CA1区注射凝聚态Aβ25-35毒性片段,构建AD疾病模型,与上述三典型证候组做阳性对照(简称AD组)。(5)假手术组模型的构建:该组大鼠颈背部皮下注射生理盐水持续48天,行为学检测前一周在大鼠大脑双侧海马CA1区注射灭菌生理盐水,与上述四组做对照。实验中,除痰浊阻窍组大鼠以高脂饲料喂养外,其余组别大鼠均以普通饲料喂养。2.疾病及证候模型的验证。检测各组大鼠抗氧化能力相关指标的改变,以验证肾精亏虚证候模型;检测血脂水平的变化,以验证痰浊阻窍证候模型;检测血液流变学的变化,以验证瘀血阻络证候模型;Morris水迷宫及海马组织尼氏染色法用以从行为学和组织形态学验证AD疾病模型。3.AD同病异证tau蛋白磷酸化位点的检测。采用蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)、免疫组织化学、免疫荧光等技术,检测AD上述三种典型证候tau蛋白磷酸化位点的差异,检测位点包括Thr181、Thr231、Ser409、Thr212、Ser396、Ser214、Thr205、Ser199、Ser404。4.与tau蛋白磷酸化相关蛋白激酶的检测。采用蛋白免疫印迹法,检测AD各证候类型组中与tau蛋白磷酸化相关蛋白激酶周期蛋白依赖激酶5(cyclin dependence kinase 5,CDK5)和糖原合成酶激酶 3β(glycogen synthesis kinase 3β,GSK3β)的表达情况。结果:1.证候模型的验证:(1)肾精亏虚证:各证候组大鼠皮层、海马抗氧化能力降低,血清NOS及脂质过氧化产物含量增多,表明给予D-gal后,大鼠的抗氧化能力降低,衰老期的肾精亏虚证候模型构建成功。(2)痰浊阻窍证:痰浊阻窍组大鼠血胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白含量增高,表明痰浊阻窍证候模型构建成功。(3)瘀血阻络证:瘀血阻络组大鼠全血高切粘度、血浆粘度增高,红细胞压积增高、纤维蛋白原含量增多,表明该组大鼠的血液处于“粘、浓、凝、聚”状态,瘀血阻络证候模型构建成功。2.疾病模型的验证:Morris水迷宫检测结果显示AD组以及不同证候组大鼠学习记忆能力下降,海马区神经元出现不同程度的凋亡,表明给予Aβ25-35毒性片段脑定位注射后,大鼠的学习记忆能力受损,AD疾病模型构建成功。3.WB检测结果:(1)肾精亏虚证:该组海马tau蛋白在Thr181、Thr231、Ser409、Thr212、Ser396位点的磷酸化水平均有增加。(2)痰浊阻窍证:该组海马tau蛋白以Thr181、Thr231、Ser409的过度磷酸化显著增加为主。(3)瘀血阻络证:该组海马tau蛋白以Thr212、Ser396的过度磷酸化显著增加为主。(4)CDK5和GSK3β两种蛋白激酶在AD组及三典型证候模型组的表达均有增加,其中GSK3β在三证候组中的增加更显著。结论:1.以D-gal长期颈背部皮下注射可制备亚急性衰老模型,模拟中医肾精亏虚证;以高脂饲料喂养大鼠可构建痰浊阻窍证候模型;以0℃冰水浴可构建瘀血阻络证候模型;大鼠双侧海马CA1区定位注射Aβ25-35可制备AD疾病模型。这几种方法结合,复合制备AD肾精亏虚证、痰浊阻窍证、瘀血阻络证病证结合模型。这一方法基本符合中医学病因病机证候理论内涵。抗氧化能力水平、血脂水平、血液流变学改变、Morris水迷宫检测、海马组织尼氏染色可以作为验证模型是否成功的生物学指标。2.AD肾精亏虚证、痰浊阻窍证、瘀血阻络证tau蛋白磷酸化位点存在差异,其中肾精亏虚证在Thr181、Thr231、Ser409、Thr212、Ser396位点的磷酸化均有增加;Thr181、Thr231、Ser409位点的过度磷酸化与痰浊阻窍证相关;Thr212、Ser396位点的过度磷酸化与瘀血阻络证相关。3.GSK3β在AD三典型证候组的表达明显增加,该蛋白激酶可能在衰老机体内参与了 Aβ25-35促进tau蛋白相关位点的磷酸化过程。4.本研究对AD不同证候在tau蛋白异常磷酸化的微观病理变化进行了比较研究,结果表明痰浊阻窍证、瘀血阻络证的特异性tau蛋白磷酸化位点在肾精亏虚证候模型中均有增加,支持了中医学对AD病机以“肾精亏虚为本,痰浊、瘀血阻滞脑络为标”的理论认识和同病异证理论。
【学位授予单位】:山东中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R749.16

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