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姜黄素的提取、分离及抑菌、抗肿瘤活性研究

李晓鹏  
【摘要】: 近年来,随着癌症发病率的不断升高,天然药物抗肿瘤作用日益成为研究热点,尤其是近年来国外也逐步重视对天然药物的应用。 本文以常用中药姜黄为材料,通过探索姜黄素的测定方法、分离方法、超高压提取方法,挥发油成分的鉴定,姜黄素的抑菌、抗肿瘤活性及挥发油抑菌的检测,建立了姜黄从有效成分提取到活性鉴定的实验方法。 实验具体分为七部分: 一、姜黄素的测定方法 通过对分光光度法及高效液相色谱法对姜黄素总含量的测定,发现姜黄素的含量与分光光度法中的吸光度及高效液相色谱法中的峰面积均成线性关系,且回收率及精密度实验均显示两种方法可靠稳定,但将两种方法的测定结果进行了比较,发现光度法的测定结果略高于色谱法。 二、姜黄素的分离方法 分别使用C_(18)与C_(30)柱,考察了三种姜黄素的分离效果,结果表明使用甲醇-水等度洗脱,在相同的洗脱条件下,三种姜黄素在C_(30)柱上的分离效果远远优于C_(18)柱,使用组成简单的甲醇-水为流动相,不必使用复杂的梯度洗脱程序就可以获得基线分离,并且分离时间也令人满意。并根据三种组分的化学结构、相对极性、色谱保留时间及紫外光谱特征分析,对三个色谱峰进行了鉴定,分别为去二甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素。 三、气相色谱-质谱分离与鉴定姜黄挥发油成分 从姜黄提取的挥发油中分离出32个色谱峰,共鉴定了22个,占被测总量的85.94%,其主要成分为:芳姜黄酮(16.06%)、β-姜黄烯(11.40%)、β-倍半水芹烯(7.27%)、大根香叶酮(6.86%)、表-α-绿芹烯(5.85%)、芳-姜黄烯(5.43%)、α-姜黄酮(5.38%)、桉树脑(5.25%)和苯甲醇(5.24%)。这与文献报道的姜黄挥发油的组成主要以萜类化合物为主基本一致。 四、超高压提取姜黄素的工艺参数优化 在测定提取溶剂、溶剂浓度、压力、提取时间、固液比、提取次数等因素对提取率的影响基础上,通过正交实验确定超高压提取过程中的最优因素组合。通过实验发现UHPE最佳提取工艺条件为:乙醇浓度70%,液固比为45:1,压力为350 MPa,提取时间3.5 min。在上述最佳提取工艺条件下,重复提取3次,总姜黄素的平均提取率为28.82 mg·g~(-1),大于正交实验结果中的最高值(28.49 mg·g~(-1)),说明利用正交实验优化UHPE提取姜黄素的提取工艺是成功的。 五、姜黄素的抑菌作用研究 提取姜黄素,利用平板打孔法和药液二倍稀释法对抑菌作用进行定性、定量测定。结果:一定浓度的姜黄色素对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、黑曲霉、白地霉都有抑制作用,其抑菌作用强弱的顺序为:大肠杆菌黑曲霉枯草芽孢杆菌酵母菌白地霉,对大肠杆菌的最低抑菌浓度是0.78mg/ml,对黑曲霉的最低抑菌浓度是1.56mg/ml,对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度是1.56mg/ml,对酵母菌的最低抑菌浓度时3.125mg/ml,对白地霉的最低抑菌浓度是6.25mg/ml。 六、姜黄挥发油的抑菌活性研究 用石油醚提取姜黄挥发油,除去石油醚,收集挥发油,配制成相应的浓度。利用平板打孔法和药液二倍稀释法对抑菌作用进行定性、定量测定。结果显示姜黄挥发油对大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌、产阮假丝酵母菌和白地霉均有抑菌作用,且大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、产阮假丝酵母的最低抑菌浓度为6.25mg/ml,白地霉的最低抑菌浓度为3.125mg/ml,但对黑曲霉无抑菌作用。其中姜黄挥发油对白地霉的抑制作用最强。 七、姜黄素对HepG_2细胞增殖的影响 用不同浓度的姜黄素处理人肝癌细胞株HepG_2细胞,采用MTT法测定姜黄素对HepG_2细胞增殖的抑制作用,结果显示,姜黄素可显著抑制肝癌细胞株HepG_2的生长,且呈现明显的时间和剂量依赖性,抑制效果在一定浓度范围内随着浓度的升高而增大,但超过一定浓度以后效果反而会降低,姜黄素浓度为20μmol/L作用48 h时抑制效果最好。


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