荷斯坦公牛SPAG11基因、Tf基因多态性及与精子质量性状的关联性分析
【摘要】：种公牛的精液品质对牛群的发展和品质改良起着极其重要的作用。尤其在人工授精和冷冻精液日益普及的今天,种公牛的作用更为重要。但种公牛的精液品质是受多基因控制的数量性状,通过常规育种方法选择周期长,效率低。随着分子生物学技术在动物育种上的应用,可对目的动物实现早期选择,显著提高选种效率。本研究选择与精子成熟及运动相关的SPAG11和Tf基因作为候选基因,以全国三大公牛站北京、上海和山东434头存栏公牛作为试验材料,通过PCR-SSCP,PCR-RFLP和DNA测序等方法检测SPAG11基因和TF基因中单核苷酸多态性(SNPs)位点,并分析这些SNPs位点及其不同单倍型与荷斯坦公牛的精液品质性状的关联性,筛查影响公牛精液品质性状的相关分子标记,为未来培育高繁殖性能的公牛提供参考依据。
一.SPAG11基因多态性与公牛精子性状关联性分析
精子相关抗原11(Sperm-Associated Antigen 11,SPAG11)是β-防御素的一种,主要在哺乳动物的附睾和雄性生殖道中表达,参与雄性生殖道的先天免疫,在附睾中参与精子的成熟,此外还参与透明带的识别和精卵结合等事件。本试验扫描了SPAG11基因,发现了6个新SNPs位点,分别为g.1306GA, g.1454GA,g.16904GT, g.16974CT, g.17000AG和g.22696TC,均为首次报道的位点,且均已递交至NCBI, SNPs登录号分别为ss 289574502,ss 289574504,ss 289574505,ss 289574507,ss 289574508和ss 289574509。
其中g.1306GA, g.1454GA突变产生了PsyI和PstI的识别位点,2个位点的酶切多态性在所研究群体中是紧密连锁的;2个位点的G、A等位基因在群体中都有分布,且处于中度多态;G和A等位基因的频率分别为79.63%和20.37%;GG,GA和AA基因型频率分别为63.70%,31.85%和4.45%;χ2适合性检验表明,该群体在这2个位点的突变达到Hardy-Weinberg平衡状态(P0.05);这三种基因型对公牛精液性状均无显著影响(P0.05)。
g.16904GT, g.16974CT, g.17000AG 3个位点采用PCR-SSCP技术进行基因分型,3个位点在所研究的群体中首次证明是紧密连锁的。EE基因型个体鲜精密度极显著高于DE基因型个体(P0.01),EE和DD基因型个体鲜精活力显著高于DE基因型个体(P0.05)。
g.22696TC位点采用创造酶切位点的方法,产生了一个Eco72I酶切位点,酶切分型发现该位点在试验群体中只存在两种基因型,且TC基因型个体较TT基因型个体有高的精子冻后活力(P0.05)和高的畸形率(P0.01)。
SPAG11基因的6个多态位点单倍型组合分析表明:共构建出8种单倍型,发现了17种单倍型组合;其中H5H6(GGT/TTC)单倍型组合个体采精量最高;H1H1(AAT/TTT)单倍型组合个体鲜精活力最高:H1H6 (AGT/TTC)单倍型组合个体精子冻后活力最高。上述单倍型组合可为高繁殖性能的公牛早期培育提供参考依据。
二.Tf基因多态性与公牛精子性状关联性分析
转铁蛋白是高等脊椎动物体内主要的铁离子结合蛋白,通过体液循环将三价铁离子从吸收部位运输到所需部位。睾丸Tf含量对精子的生成和发育有影响作用。根据NCBI的登录号ss 250608649、ss 250608650和ss250608651,经测序,在本试验群体公牛个体中也证实存在-1748GA、13942TC和14037 AG 3个SNPs,分别位于5’调控区、外显子8和内含子8区。与精子性状的相关性分析表明:13942TC三种基因型间CC个体精子畸形率显著低于TT个体(P0.05)。-1748GA和14037 AG突变位点不同的基因型对精子性状均无显著性影响(P0.05)。
Tf基因3个多态位点单倍型组合分析表明:共构建出6种单倍型,发现了14种单倍型组合;其中H3H3(GAT/GAT)单倍型组合个体采精量和体鲜精密度最高;H1H1(AAT/AAT)单倍型组合个体鲜精活力和精子冻后活力最高。上述单倍型组合可为高繁殖性能的公牛早期培育提供参考依据。
研究了Tf mRNA在公牛6种不同组织中的表达量,结果显示Tf mRNA在公牛肝脏中的水平最高,睾丸中的水平比肾脏、脾脏和肺中的水平高。
【关键词】：荷斯坦公牛 SPAG11基因 Tf基因 多态性 精液品质 单倍型 【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：S823
【目录】：
- 英文缩写说明5-6
- 摘要6-8
- ABSTRACT8-11
- 第一章 文献综述11-22
- 1 我国公牛产业的发展现状11-12
- 2 SPAG11 的研究进展12-17
- 3 Tf 的研究进展17-19
- 4.SNP检测研究方法19-22
- 第二章 SPAG11 基因多态性与荷斯坦公牛精液品质性状的关联分析22-49
- 1 材料与试剂22-26
- 2 实验方法和步骤26-35
- 3 结果与分析35-46
- 4 讨论46-49
- 第三章Tf 基因多态性与荷斯坦公牛精液品质性状的关联分析及Tf mRNA 在公牛不同组织的表达49-66
- 第一部分 Tf 基因多态性与荷斯坦公牛精液品质性状的关联分析49-59
- 1 材料与试剂49
- 2 实验方法和步骤49-51
- 3 结果与分析51-58
- 4 讨论58-59
- 第二部分 Tf m RNA 在公牛不同组织的表达59-66
- 1 材料与试剂59
- 2 试验方法和步骤59-62
- 3 结果与分析62-64
- 4 讨论64-66
- 结论66-68
- 参考文献68-73
- 致谢73-74
- 附录74
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