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《山东师范大学》 2011年
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几丁质脱乙酰酶产生菌的诱变筛选及发酵条件优化

刘丽  
【摘要】:几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase, CDA)是能够脱除几丁质长链分子中的N-乙酰基的一种水解酶,该酶最早由Araki等人在毛霉Mucor rouxii中获得。目前发现的能够产生几丁质脱乙酰酶的微生物多数为真菌,从真菌中分离得到几丁质脱乙酰酶主要为糖蛋白,分子量大多为75-150kd。几丁质脱乙酰酶能够催化几丁质生成壳聚糖,代替工业上强碱法处理几丁质生产壳聚糖,酶法转化生产壳聚糖具有工艺条件温和、环境友好、产品质量高等优点。几丁质脱乙酰酶由微生物产生,因此获得几丁质脱乙酰酶产生菌,提高菌株几丁质脱乙酰酶酶活值,是本课题的一个重要研究内容。本课题从实验室保藏菌株复壮活化开始,诱变筛选几丁质脱乙酰酶高产菌株,主要开展了以下研究工作: 从实验室保藏菌株Rhodococcus sp.Y-104(几丁质脱乙酰酶酶活946.11U/ml)出发,以对对硝基乙酰苯胺的脱乙酰作用为初筛指标,对胶体几丁质的脱乙酰度为复筛指标,经活化复壮得到一株酶活值较高的菌株L79(几丁质脱乙酰酶酶活1649.07U/ml),采用紫外线、硫酸二乙酯和紫外线-氯化锂复合处理对菌株L79进行诱变,经过平板初筛和摇瓶发酵初筛、复筛筛选到一株产酶水平较高几丁质脱乙酰酶突变株D9,产酶活力达到2855.36U/ml,比出发菌株酶活力提高了73.15%,对突变株D9和出发菌株L-79进行了菌体形态分析。由于菌株D9经过多次诱变获得,某些特性及产酶条件可能发生改变,对几丁质脱乙酰酶高产突变株D9进行发酵产酶条件优化。单因素实验确定了适合菌株D9发酵产酶的最佳碳源为蔗糖,氮源为鱼粉蛋白胨、玉米浆,无机盐磷酸二氢钾、硫酸锰以及乙酸钠,借助Minitab软件设计对影响CDA产生的六个因素进行了Plackett-Burman实验,确定了影响菌株D9产酶的三个重要因素蔗糖、鱼粉蛋白胨、磷酸二氢钾。随后又进行了最陡爬坡实验和Box-Behnken设计实验,确定了最佳培养基组成,蔗糖21.26g/L,鱼粉蛋白胨26.03g/L,磷酸二氢钾0.89g/L,乙酸钠4.5g/L,玉米浆2.5g/L。对优化后的培养基进行了验证试验,测得酶活值为6619.86U/mL。与诱变前菌株L79发酵测得的酶活值1649.07U/mL相比,酶活值提高了3.01倍。 几丁质脱乙酰酶在常温下性质稳定,60℃以上失活,酶最适反应温度为50℃,pH7.0-9.0时具有较高的稳定性,最适pH值8.0,Fe~(2+)、Fe~(3+)对酶具有显著的抑制作用,Mn~(2+)对酶具有较高的激活作用。 综上所述,突变株D9所产生的几丁质脱乙酰酶具有较好的温度和pH值稳定性,是一株具有开发潜力的几丁质脱乙酰酶生产菌株。
【学位授予单位】:山东师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:TQ920.6

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