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《山东师范大学》 2011年
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小鼠球形精子受精胚胎制备及培养方法的改进

刘愿  
【摘要】:球形精子可作为精子的替代品应用于基础生殖研究以及临床上不育症的治疗。以往球形精子受精胚胎是在显微操作仪的辅助下得到的,而随着手工克隆技术的使用,显微操作仪不再是核移植技术中必须配备的仪器。本研究利用手工克隆技术的思路,将球形精子与去透明带卵母细胞融合以获得球形精子受精卵,并对其进行培养。 在本研究的主要内容包括:用不同方法制作的小凹及不同培养液培养小鼠去透明带体内受精卵,建立去透明带胚胎的培养体系;比较不同方法对小鼠去透明带卵母细胞孤雌激活的效果,为小鼠去透明带卵母细胞的孤雌激活提供参考依据,进而为小鼠球形精子融合胚胎的激活探索最合适的激活条件;用电融合的方法构建小鼠球形精子受精卵,比较不同电压对小鼠球形精子与卵母细胞融合效率的影响,以寻求最适电压从而提高球形精子受精胚胎的构建效率。本论文所得到的主要结论如下: 1)对WOW(the well of the well, WOW)系统进行改进,用金属针、玻璃针及胚胎聚集针分别制作小凹,比较这三种方法制作的小凹对小鼠去透明体内受精卵的培养效果,发现胚胎聚集针所做小凹的囊胚发育率显著高于金属针及玻璃针(55.61% vs 44.38%、43.16%)。而卵裂率与4-细胞率则不受小凹制作方法的影响,三者无显著差异。此实验说明:胚胎聚集针所做小凹培养去透明带受精卵的效果最好。分别用CZB,M16及KSOM培养液在胚胎聚集针所做的小凹内培养去透明带受精卵,三种培养液所培养胚胎的卵裂率、4-细胞率及囊胚率均无显著性差异。 2)分别用2mmol/L、4mmol/L及10mmol/L的SrCl_2与5μg/mL CB联合作用于去透明带卵母细胞30min,均可激活小鼠去透明带卵母细胞,但三种激活方法处理卵母细胞后得到的胚胎死亡率与卵裂率(13.22%、12.62%、16.54%)均无显著差异,且都不能使孤雌激活胚胎发育至囊胚阶段。由此可知2mmol/L、4mmol/L及10mmol/L三种浓度的SrCl_2虽可以激活卵母细胞,使之卵裂,但均不能使激活后的卵母细胞继续发育。 选取对小鼠卵母细胞孤雌激活效率较高(16.54%)的SrCl_2浓度:10mmol/L,分别处理3h、4h及5h,三个处理组之间卵母细胞的死亡率无显著性差异;3h处理组的卵裂率显著高于4h与5h处理组(61.40% vs 49.12%、47.95%);5h处理组得到的桑/囊胚率显著高于3h与4h处理组(23.29% vs 10.53%、14.04%)。该实验表明,10mmol/LSrCl_2结合5μg/ml CB作用3h可使小鼠无透明带卵母细胞达到最高激活率,延长SrCl_2作用时间至5h可显著提高小鼠孤雌激活胚胎的桑/囊胚得率。 3)用电融合的方法使小鼠球形精子与去透明带卵子发生融合,采用脉冲宽度为10μs,脉冲次数为1,电压分别为60V/mm, 80V/mm, 100V/mm的直流电脉冲作用于球形精子-卵母细胞对,其融合率分别为50.00%、38.55%及39.59%,其中60V/mm得到的融合率显著高于80 V/mm及100V/mm。融合后胚胎的卵裂率及桑/囊胚率在三组之间无显著性差异。
【学位授予单位】:山东师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q813

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