松花粉多糖及其酯化物对小鼠胰岛细胞胰岛素分泌机制的研究

【摘要】：硫酸酯化后的马尾松花粉多糖，部分羟基被硫酸基取代，从而具有了静电排斥效应和空间位阻，改变了多糖原有的空间结构，易与蛋白质的特定结构域结合，从而影响其功能和生物活性的改变。经本实验室研究发现：60%乙醇沉淀的马尾松花粉多糖（PPM60）及其酯化物（SPPM60）可以不同程度地提高大鼠心肌细胞、小鼠脾细胞的细胞内游离钙离子浓度；同时降低了原代培养的大鼠血管平滑肌细胞内的游离钙离子浓度（[Ca~(2+)]_i）。而[Ca~(2+)]_i是胰岛素分泌的重要影响因素之一。 马尾松花粉多糖及其酯化物是否作用于胰岛β细胞，引起细胞内钙离子浓度的变化，从而导致胰岛素的分泌，目前还不清楚。本实验对马尾松花粉多糖及酯化物引起小鼠胰岛β细胞胰岛素分泌的机制进行初步探讨。为松花粉多糖的利用及开发辅助治疗糖尿病的新药提供思路。本实验可分为以下三部分。 一、马尾松花粉多糖（PPM60）的分离纯化、硫酸酯化及鉴定：选取60%乙醇沉淀组分PPM60用Sephacryl S-400HR凝胶柱层析对多糖进行分离纯化，分离出PPM60-A、PPM60-B、PPM60-C三种分子量较均一的组分。用氯磺酸-吡啶法对PPM60及其纯化的各部分进行硫酸酯化修饰，得到白色絮状产物SPPM60、SPPM60-A、SPPM60-B和SPPM60-C。用氯化钡-明胶比浊法对酯化多糖进行SO_4~(2-)含量测定并计算其取代度分别为1.494、1.58、1.31、1.19。紫外、红外光谱显示：其具有多糖类的特征吸收峰和硫酸酯键（C-O-S和S=O）的特征吸收峰，这些表明此松花粉多糖硫酸酯化成功。 二、PPM60及SPPM60对小鼠胰岛β细胞（MIN6细胞系）胰岛素分泌的影响：用酶联免疫吸附实验法检测PPM60及SPPM60刺激后MIN6细胞上清液中胰岛素的分泌量。200μg/mL的SPPM60刺激细胞1小时，对MIN6细胞胰岛素分泌有极显著地促进作用。而PPM60对MIN6细胞的胰岛素分泌几乎没有作用。加入L型钙离子通道的抑制剂维拉帕米或细胞内钙库上的IP3受体的抑制剂低分子肝素钠后，再加SPPM60进行刺激，对于SPPM60引起的胰岛素分泌有一定程度的抑制作用，但作用不显著。 三、SPPM60对MIN6细胞内游离钙离子浓度（[Ca~(2+)]_i）的影响：MIN6细胞经过钙离子荧光探针Fura 2-AM负载后，用荧光分光光度计检测SPPM60作用后[Ca~(2+)]_i的变化。SPPM60在5min作用时间内，与对照组相比能促进细胞内[Ca~(2+)]_i显著升高。加入L型钙离子通道抑制剂维拉帕米（Verapamil）后再加SPPM60刺激，部分抑制了SPPM60引起的[Ca~(2+)]_i升高。加入细胞内钙库IP3受体抑制剂低分子肝素钠（LMWH）后再加SPPM60刺激，[Ca~(2+)]_i与单独加入SPPM60组相比有显著性降低，但是没有降到空白水平。 以上结果表明：（1）PPM60对MIN6细胞胰岛素分泌几乎没有影响，硫酸酯化后的SPPM60能显著促进胰岛素的分泌。（2）SPPM60促进MIN6细胞胰岛素分泌可能与细胞内游离钙离子浓度的升高有关。（3）SPPM60促进MIN6细胞[Ca~(2+)]_i升高可能与细胞膜上电压依赖性的钙离子通道的开放和IP3敏感钙库的钙离子释放有关。

【关键词】：花粉 酯化多糖 小鼠胰岛β细胞 胰岛素 [Ca~(2+)]_i
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R587.1
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