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《山东师范大学》 2017年
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鲤鱼早期发育阶段肠道菌群的分析及其免疫相关性研究

王蕾  
【摘要】:鱼类肠道中存在丰富的细菌类群,受宿主基因型、肠道微环境、发育阶段、食性以及外环境因子等的影响,处于不断的动态变化中,对鱼类的营养、免疫和发育等过程起重要作用。鲤鱼是重要的淡水经济鱼类,也是重要的蛋白质来源之一。近年来,随着养殖密度的增加,爆发性出血病等细菌性疾病越来越严重,给水产养殖造成巨大损失,因此,本论文利用高通量测序技术研究了天然养殖池塘中鲤鱼幼鱼肠道菌群的组成、来源和多样性,以及在浸泡免疫刺激下肠道菌群和肠组织免疫相关基因表达的变化趋势。本论文以胚胎期、仔稚鱼期和幼鱼期鲤鱼为实验材料,选择受精卵、卵黄囊期、开口摄食后1、3、14、21、28、42和63天共9个时间点,研究了肠道菌群的组成及其与饲料和池塘水菌群之间的相关性。结果发现,鲤鱼肠道菌群的组成随发育过程发生了动态变化,变形菌门、蓝藻细菌、厚壁菌门和放线菌门等细菌门类存在于所有鲤鱼样本中,但是在不同样本中的相对含量有差异;不同发育阶段的优势属发生了较大变化,没有优势属存在于所有发育阶段的样本中;所有发育阶段的鲤鱼样本共同含有1个核心细菌种类(γ-变形菌纲某种类),而且该种类在不同发育阶段的相对含量差异极显著(one-way ANOVA,P0.0001),但是鲤鱼肠道样本的优势菌与池塘水样本和饲料样本的差异很大。α-多样性指数分析结果可见,伴随发育过程,鲤鱼样本的菌群多样性和丰度发生了波动性变化,开口摄食后1天菌群多样性最高,63天菌群多样性最低;开口摄食后3天菌群丰度最高,28天菌群丰度最低;鲤鱼肠道样本的菌群多样性指数低于池塘水样本,但是高于饲料样本。进行相似性分析(Anosim)发现,除开口摄食后28和42天(R=0.111),以及42和63天(R=0.444)之外,发育过程中任何两个相邻阶段鲤鱼肠道菌群之间存在明显的组间差异,但差异不显著(R≥0.889,P=0.1);鲤鱼肠道菌群跟池塘水样本菌群之间存在显著差异(R=0.715,P=0.001)。对比受精卵及其所处池塘水(WE)中的菌群组成可见,受精卵中有66.5%的OTUs也存在于WE中,而且这些OTUs所包含的reads数占总reads数的95.9%,说明池塘水为受精卵提供了菌群来源。进一步的非度量多维尺度分析(NMDS)和主坐标分析(PCoA)可见,与饲料样本相比,池塘水样本跟鲤鱼样本尤其是开口摄食后1天及以前发育阶段的鲤鱼样本的相似性更高。本论文进一步研究了混养池塘中6月龄鲤鱼肠道菌群的组成,与共同混养的鲫鱼和草鱼肠道菌群之间的异同,以及与池塘底泥和池塘水等环境菌群的异同。结果发现,鲤鱼肠道中变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、柔膜菌门和梭杆菌门含量较高,气单胞菌属和乳球菌属含量占优;鲫鱼肠道中变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门含量较高,气单胞菌属和鲸杆菌属含量占优;草鱼肠道中变形菌门、梭杆菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和螺旋体门含量较高,拟杆菌属含量占优;鲤鱼、鲫鱼和草鱼分别含有212个、103个和57个核心细菌种类,三者共有22个核心细菌种类,但是特有的和共有的核心细菌种类在不同样本中的相对含量有一定差异。α-多样性指数分析结果可见,鱼类肠道菌群的多样性和丰度明显低于池塘底泥和池塘水等外部环境,鲤鱼肠道菌群的多样性和丰度高于鲫鱼和草鱼。进一步分析发现,相比较于食性不同的草鱼,食性相似的鲫鱼与鲤鱼肠道菌群的相似性更高;鲤鱼肠道内容物和肠道粘液中菌群组成差异不明显。由样品聚类树与含量柱状图组合分析图(Tree_bar)和多样品对比树状图(Hcluster_tree)分析可见,鲤鱼与鲫鱼肠道粘液首先聚类,然后先后与鲤鱼和鲫鱼肠道内容物聚类,与聚类在一起的草鱼肠道内容物和肠道粘液在进化树的不同分支上。比较6月龄鲤鱼与开口摄食后63天鲤鱼幼鱼的肠道菌群可见,两者之间存在明显的组间差异,但差异不显著(Anosim分析,R=1,P=0.1);两个发育阶段的池塘水中菌群组成和多样性及丰度发生了变化;虽然生存水环境中的菌群多样性6月龄鲤鱼低于开口摄食后63天鲤鱼幼鱼,但是肠道菌群多样性6月龄鲤鱼高于开口摄食后63天鲤鱼幼鱼。本论文以天然养殖池塘中养殖的开口摄食后42天的鲤鱼幼鱼为实验材料,研究了爆发性出血病病原菌嗜水气单胞菌浸泡免疫刺激后鲤鱼肠道菌群的变化及肠和脾脏免疫相关基因表达的变化,同时还对肠道菌群与组织免疫相关基因表达变化之间的相关性进行了分析。鲤鱼幼鱼在实验室条件下适应两周后进行刺激实验,刺激用嗜水气单胞菌终浓度为1×10~8个/ml,第一次浸泡刺激时长40分钟,并在3天后取材;第二次浸泡刺激在第一次浸泡刺激后7天进行,时长为40分钟,并在刺激后1小时取材。分析刺激组(包括第一次刺激后3天的CCe3和第二次刺激后1小时的CCe7)与对照组(包括第一次刺激后3天的CCc3和第二次刺激后1小时的CCc7)的结果,发现刺激后鲤鱼肠道菌群发生了变化。比较CCc3、CCe3和CCe7样本可见,三个样本中含量较高的门类都为变形菌门和梭杆菌门,但是免疫刺激后梭杆菌门与变形菌门的相对含量比降低;鲸杆菌属的相对含量在刺激前后变化不大,但是鲸杆菌属中Cetobacteriun sp.ZOR0034的相对含量先降低再升高,而且刺激组中的相对含量低于对照组,另外,弧菌属中霍乱弧菌的相对含量在刺激后明显升高;刺激前后肠道中存在核心菌群,共有22个细菌种类,而且这些共有的细菌种类在各样本中的相对含量都较高。α-多样性指数分析结果可见,CCc3、CCe3和CCe7组样本的菌群多样性和丰度均依次升高,但是都低于CCc7样本;样本聚类分析发现,刺激组样本聚类在一起,组间聚类分析后发现CCe3和CCe7聚类后,再与CCc3聚类,最后与CCc7聚类在一起;由NMDS和PCoA分析可见,刺激组样本聚在一起,CCc3-2与CCc3-3样本相对集中,CCc3-1与CCc7组样本相对集中;由Anosim分析可见,CCc7和CCe7之间有明显的组间差异,但差异不显著(R=1,P=0.1)。本论文利用高通量测序方法对刺激前后肠和脾脏组织的转录组进行测序,并以公开发表的鲤鱼基因组为参考对测序数据进行对比分析及注释,结果发现刺激前后肠和脾脏样本存在很多差异表达基因。对表达数据进行主成分分析(PCA)可见,肠和脾脏样本的表达基因存在差异,而且刺激后两者的表达基因发生了变化。将显著上调或者下调的基因进行筛选发现,在肠组织中,与对照(CCic)相比,第一次刺激后3天的样本(CCie3)有19个、第二次刺激后1小时的样本(CCie7)有9个免疫相关基因发生了显著变化;脾脏组织中,与对照(CCsc)相比,第一次刺激后3天的样本(CCse3)有16个、第二次刺激后1小时的样本(CCse7)有17个免疫相关基因发生了显著变化。将全部差异表达基因进行GO富集分析发现,两次刺激后执行不同生物学功能的差异表达基因数量和类型都有差异。进一步将差异表达基因进行KEGG富集分析发现,与免疫相关的差异表达基因参与的信号通路主要有抗原加工和递呈通路(Antigen processing and presentation)、NOD样受体信号通路(NOD-like receptor signaling pathway)、补体和凝结级联信号通路(Complement and coagulation cascades)、TRP通道炎症介导调节通路(Inflammatory mediator regulation of TRP channels)、RIG-I样受体信号通路(RIG-I-like receptor signaling pathway)和Fc-ε受体I信号通路(Fc epsilon RI signaling pathway)等,以天然免疫相关信号通路为主。上述结果表明,鲤鱼早期发育阶段肠道菌群会随发育过程而发生连续的、温和的变化,池塘水环境等可能为鲤鱼肠道菌群提供了菌种资源,并会对鲤鱼肠道菌群的变化产生一定影响,但是宿主的选择压力在塑造肠道菌群的过程中所发挥的作用更大;尽管肠道菌群受多种因素的影响,核心菌群的存在说明某些细菌种类适应鲤鱼肠道的微环境并在其生长过程中起一定作用。混养池塘中的6月龄鲤鱼,与鲫鱼和草鱼肠道菌群差异不明显,而且食性可能是影响肠道菌群的重要因素;鲤鱼不同个体间存在多种核心细菌种类,而且鲤鱼、鲫鱼和草鱼之间也共有某些核心细菌类群,并且三种鱼肠道菌群的组成、多样性及丰度与池塘水和池塘底泥的差异更明显,说明宿主的选择压力对肠道菌群的影响更大;鲤鱼肠道内容物和肠道粘液中的菌群差异不明显;开口摄食后63天,鲤鱼幼鱼的肠道菌群仍然处于变化中,而且跟环境样本的相关性要小于自身的内在因素。病原菌的浸泡免疫刺激能够影响鲤鱼幼鱼肠道菌群的组成,以及肠和脾脏免疫相关基因的表达,相比较而言,差异表达基因所参与的天然免疫相关信号通路多于获得性免疫相关信号通路,但是总体上看,这些通路的数量并不多,可能是因为幼鱼期鲤鱼对细菌性病原菌的反应弱于成年鱼,也可能是因为所参考的鲤鱼基因组目前注释尚不全面从而影响了差异表达基因的功能定位;肠道菌群的变化可能跟肠和脾脏免疫相关基因的差异表达有一定相关性,但是两者之间的因果关系尚不明确。综上所述,本论文的研究不仅可以了解鲤鱼发育过程中肠道菌群的变化规律,同时也为研究鲤鱼肠道菌群与鱼类免疫系统发育和免疫应答的相关性提供基础资料,进而为鲤鱼的健康养殖和疾病预防提供理论基础。
【学位授予单位】:山东师范大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S917.4

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