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《山东师范大学》 2019年
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基于单个量子点纳米传感器对末端脱氧核苷酸转移酶的检测研究

罗明丽  
【摘要】:末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)是一种独特的无模板聚合酶,负责将任意单个核苷酸加到单链DNA的3'-羟基(3'-hydroxyl,3'-OH)末端以产生随机遗传信息。末端脱氧核苷酸转移酶的异常表达与人类白血病有关,因此对其活性的高灵敏检测在生物医学研究和临床诊断方面具有十分重要的意义。量子点(quantum dots,QDs)是由II-VI和III-V周期族元素组成的新型半导体纳米晶体,常用于荧光标记,在化学、生物学和医学研究领域具有广泛的应用。在这里,本文研发了一种基于聚合反应引发的由核酸外切酶III(exonuclease III,Exo III)辅助形成的单个量子点的纳米传感器,用于简单、灵敏、快速地检测末端脱氧核苷酸转移酶活性。该检测方法分为三个步骤:(1)末端脱氧核苷酸转移酶引发的DNA引物的无模板聚合延伸,(2)核酸外切酶III介导的Cy5-dsDNA-QD纳米结构上的Cy5分子的循环释放,(3)基于单个量子点的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)的测量。末端脱氧核苷酸转移酶能够在单链DNA引物的3'-OH末端聚合产生多聚胸腺嘧啶(thymine,T)核苷酸的DNA产物,其可与量子点表面修饰的捕获探针杂交,形成Cy5-dsDNA-QD纳米结构,从而引发从量子点供体到Cy5受体的高效荧光共振能量转移。Cy5-dsDNA-QD纳米结构上的双链DNA可作为核酸外切酶III的底物,引发捕获探针被核酸外切酶III从3'端到5'端的消化,导致Cy5分子从Cy5-dsDNA-QD纳米结构上解离,同时释放富含T的DNA产物。Cy5分子的解离导致量子点和Cy5之间的荧光共振能量转移效率降低。基于全内反射荧光(total internal reflection fluorescence,TIRF)的单分子成像,通过简单地Cy5分子数点,末端脱氧核苷酸转移酶活性可以得到精确的定量。该方法无需任何分离步骤、简单快速,整个反应时间为50 min,检测限低至1×10~(-6) U/μL。此外,它还可用于末端脱氧核苷酸转移酶抑制剂的筛选,准确定量低至5个癌细胞中的末端脱氧核苷酸转移酶活性。
【学位授予单位】:山东师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:O657.3;O629.8;TP212

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