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《山东师范大学》 2019年
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基于量子点的荧光共振能量转移的生化分析应用研究

胡娟  
【摘要】:半导体量子点(QD)具有有机染料分子和荧光蛋白所不具备的独特光物理性质:亮度高、量子产率高、光稳定性好、吸收光谱宽和发射光谱窄且大小可调等,量子点的直径与生物分子大致相当。量子点与荧光共振能量转移(FRET)相结合在生化分析领域有广阔应用前景。本论文结合单分子检测、等温扩增技术,以及微粒、3D DNA纳米结构材料,发展了一系列基于量子点的FRET的新型生物传感体系,并将其应用于蛋白转移酶、循环DNA、miRNA、核酸酶和甲基转移酶等生物分子的超灵敏检测。主要研究内容如下:1.基于单个量子点的FRET用于测定氧-N-乙酰葡萄糖胺转移酶(OGT)活性我们发展了一种基于单个量子点的FRET检测氧-N-乙酰葡萄糖胺转移酶(OGT)活性的新方法。OGT酶负责蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰,是一种细胞内源酶。OGT酶活性的失调与癌症、糖尿病、阿尔兹海默症等多种疾病相关。我们设计一种Cy5/biotin修饰的肽链,此肽链具有能够被OGT糖基化的丝氨酸和与之相邻的蛋白酶识别的位点。此O-GlcNAc糖基化修饰过程以普通的非放射性UDP-GlcNAc作为糖基供体,以Cy5/biotin修饰的肽链作为底物。当目标检测物OGT酶存在时,OGT酶催化糖基化反应产生糖基化的肽链,导致其不能够被蛋白酶消化。随后该糖基化的肽链通过生物素-链霉亲和素的作用自组装到量子点表面的链霉亲和素上,形成量子点-肽-Cy5的纳米结构,导致量子点与Cy5之间发生FRET。通过在单分子水平上检测Cy5信号,可对OGT酶活性进行定量分析。该OGT酶活性分析方法简单直接,不需要酶纯化、放射性同位素标记的糖基供体、特异性抗体以及糖基供体的荧光衍生物等,选择性和灵敏度高,OGT酶的检测限低至3.47×10~(-13)mol/L。该方法还可应用于酶反应动力学分析、细胞内OGT酶活性分析以及筛选OGT抑制剂。2.联合微粒与基于量子点的FRET用于灵敏检测循环DNA我们建立了一种联合微粒(MP)与基于量子点的FRET检测循环DNA(ctDNA)的新方法。ctDNA是携带肿瘤特异性序列突变的DNA片段,它通常在总循环DNA中含量较小。我们设计了一种两端biotin修饰的连接探针,此探针能够与链霉亲和素修饰的微粒和605QD互相连接。靶标ctDNA能够与捕获探针和报告探针进行杂交反应形成三明治杂交双链,随后连接到MP-Link-605QD复合物结构的链霉亲和素上,形成MP-Link-605QD-dsDNA-Cy5复合物,导致605QD和Cy5之间发生FRET。这种复合物结构能够提高受体敏化发射效率值,从而更有益于目标DNA的灵敏检测。Cy5的信号能够由单分子检测方法确定,该方法具有操作简便、灵敏度高、样本消耗量低的优点。3.联合等温扩增与基于量子点的FRET用于同时检测多种microRNAMicroRNA(miRNA)是一类能够调节许多重要生理过程的非编码小RNA。miRNA的失调与人类各种疾病密切相关,同时灵敏的检测多种miRNA在早期临床诊断方面具有重大意义。我们发展了一种联合等温扩增(HRCA)与基于量子点的FRET同时检测多种miRNA的新方法。该方法的特点在于以一种单色量子点(525QD)作为能量供体,以两种荧光染料分子(Cy3和Texas Red)作为其能量传递的受体,实现了miR-21和miR-221两种miRNA的同时检测。我们设计了两种环模板,可以分别与miR-21和miR-221进行特异性杂交反应,引发HRCA反应。HRCA反应的产物与biotin标记的捕获探针和受体分子标记的报告探针进行三明治杂交反应。这种三明治杂交链能够组装到525QD表面,导致525QD和能量受体之间发生有效的FRET。Cy3的信号能够指示miR-21的存在,Texas Red的信号能够指示miR-221的存在。在该方法中,不同的miRNA引发的HRCA能够在恒温条件下进行反应;不同的miRNA可使用同一种反向引物进行扩增;不同miRNA的HRCA反应产物能够与同一种捕获探针进行特异性杂交反应,因而此方法操作简单、成本低廉。这种方法的特异性高,灵敏度高,miR-21检测限低至7.2×10~(-16) M,miR-221检测限低至1.6×10~(-17) M。该方法还可用于癌细胞中多种miRNA的同时检测,在生物医学研究和临床诊断具有潜在应用价值。4.联合四面体DNA与基于量子点的多重FRET用于同时测定多种酶活性我们提出了一种联合四面体DNA与基于量子点的多重FRET同时测定多种酶活性的新方法。我们联合链霉亲和素修饰的525QD与biotin、Cy3、Texas Red和Cy5标记的四面体DNA,得到了一种3D DNA纳米结构。四条单链DNA经由简单的退火过程组装成四面体DNA,后通过生物素-链霉亲和素的作用组装到525QD表面的链霉亲和素上,得到525QD-Cy3-Texas Red-Cy5四面体DNA。这个结构能够在525QD与Cy3、Texas Red和Cy5三种有机荧光分子之间产生多重FRET路径。我们能够利用此类四面体DNA精确地调控各种荧光物质的位置,从而精确地控制能量传递路径和FRET效率。该纳米结构能够很容易的确定荧光物质之间的分离距离,具有精确控制供体、中间受体和终端受体之间能量传递的能力,四种荧光物质的同时发射光谱能够用于多相检测。这种纳米结构可用于多种核酸酶和甲基转移酶的同时检测,可用于复杂体系内反应和筛选酶的抑制剂。
【学位授予单位】:山东师范大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:O657.3;O471.1

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