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盐胁迫下盐地碱蓬液泡膜质子泵表达分析及过量表达SsNHX1-AVP1对拟南芥耐盐性的影响

李平华  
【摘要】: 盐分胁迫主要包括渗透胁迫及离子胁迫。渗透胁迫、离子胁迫及其造成的一系列次级胁迫如氧化胁迫等,严重干扰植物体内业已存在的细胞及整株水平上的水分及离子稳态,造成植物细胞分子损伤,生长减缓甚至死亡。因而植物对抗盐胁迫的一个重要策略是在高盐环境下重建体内的稳态(homeostasis),包括重建离子稳态(ionic homeostasis)和渗透稳态(osmotic homeostasis)。本实验以典型的积盐型盐生植物盐地碱蓬为材料,探讨了盐对盐地碱蓬液泡膜H~+-ATPase、H~+-PPase基因及蛋白表达的影响,分析了液泡膜H~+-ATPase、H~+-PPase、Na~+/H~+ antiporter对Na~+液泡区隔化的作用;构建了同时含有液泡膜H~+-PPase与Na~+/H~+ antiporter基因的双元植物表达载体并转化拟南芥;分析了同时过量表达SsNHXI-AVP1基因对拟南芥耐盐性的影响,主要实验结果如下: 1.盐地碱蓬液泡膜H~+-ATPase B、H、c亚基基因克隆及序列分析 利用EST随机挑取克隆测序的策略从盐地碱蓬叶片cDNA文库分离得到编码盐地碱蓬液泡膜H~+-ATPase B、H、c亚基的全长cDNA序列。盐地碱蓬液泡膜H~+-ATPase B亚基是由1470个核苷酸编码的长达489个氨基酸的多肽,分子量约54.29kDa,存在保守的ATP结合序列“324-SGSIT-328”,与其他物种来源的V-H~+-ATPase B亚基具有较高的氨基酸序列相似性;H亚基为亲水多肽,开放阅读框长达1398-bp,编码465个氨基酸残基,分子量约52.8kDa,与植物来源的液泡膜H~+-ATPase H亚基具有较高的氨基酸序列相似性,而与其他物种来源的V-H~+-ATPase H亚基同源性较低;c亚基开放阅读框为495-bp,编码164个氨基酸残基,分子量约16.6kDa,为一跨膜多肽,存在四个可能的跨膜区。盐地碱蓬液泡膜H~+-ATPase c亚基第四个跨膜区存在高度保守的谷氨酸残基,先前的研究表明此谷氨酸残基可能与H~+跨脂双层运输有关。 ClustalX分析表明盐地碱蓬液泡膜H~+-ATPase B、H、c亚基氨基酸序列与来源于兼性CAM植物冰叶日中花液泡膜H~+-ATPase的相应亚基具有最高的序列一致性,表明植物液泡膜H~+-ATPase B、H、c亚基的进化可能与环境刺激有关并且可能参与了植物对盐胁迫的响应。 2.NaCl胁迫对盐地碱蓬液泡膜H~+-ATPase、H~+-PPase基因表达及酶活性的影响Northern分析表明盐胁迫明显诱导了盐地碱蓬液泡膜H~+-ATPase B、H、c亚基基因转录。400 mmol/L NaCl处理盐地碱蓬植株0-120 h发现盐胁迫明显诱导了盐地碱 盐胁迫下盐地碱茨液泡膜质子泵衷达分析及过量系达印MHXAw】对拟甫芥耐盐性的影响 蓬液泡膜 H”-ATPase B、H亚基基因表达;100、400 mmol/L NaCI处理盐地碱蓬植株, 分析其叶片液泡膜H”.ATPase亚基基因表达也发现盐胁迫明显诱导了盐地碱蓬液泡膜 H\ATPase B。H、c亚基基因表达并且其表达量随盐处理浓度的增加而增大。液泡膜 H\ATPase B、H亚基位于 H\ATPase V;区而 c亚基位于 H\ATPase V。区,三者基因 表达均为盐胁迫所诱导证明盐胁迫下盐地碱蓬液泡膜 H”-ATPase B、H、c亚基基因表 达存在协同作用。 对生长四周,幼嫩的盐地碱蓬植株及生长10周处于衰老期的盐地碱蓬植株进行 400 mmol/L NaCI处理,分离其根、茎、叶总RNA进行Northern分析发现盐地碱蓬 液泡膜 H“-ATPase B、H、c亚基基因表达与植株发育有密切关系。生长旺盛(生长四 周)的软地碱蓬植株,其根、茎、叶液泡膜 H”-ATPase B、H、c亚基基因表达均明显 高于生长十周处于衰老期的盐地碱蓬植株:另一方面,无论是生长四周,幼嫩的欢地 碱蓬植株还是生长十周处于衰老期的盐地碱蓬植株,无论是在根还是在茎和叶,煞胁 迫均明显诱导了液泡膜 H”-ATPase B、H、c亚基基因表达,进一步证明盐胁迫下盐地 碱蓬液泡膜 H”-ATPase B、H、c亚基基因表达存在协同作用。 100、400 mmol/L NaCI 处理盐地碱蓬植株分离其叶片液泡膜微囊进行 Western七lot分析发现盐胁迫明显诱导了盐地碱蓬液泡膜H”-ATPase B、c亚基蛋白的 友达,证明盐胁迫下,款地碱蓬液泡膜H”-ATPase各亚基在转录、翻译水平存在协同 表达。100、400 mmol/L NaCI处理亦明显增加了盐地碱蓬叶片液泡膜微囊 H\ATPase 活性,表明盐胁迫下,盐地碱蓬液泡膜H”-ATPase各亚基在转录、翻译水平的协同表 达增加了H”-ATPase全酶的数量,进而增大了H”-ATPase的活性。 400 mmol/L NaCI处理盐地碱蓬植株0-72 h发现盐胁迫诱导了盐地碱蓬液泡膜 汁-PPase基因表达;100、400 mmol/L NaCI处理盐地碱蓬植株分离其叶片液泡膜微 囊进行Western七lot分析发现盐胁迫诱导了盐地碱蓬液泡膜H“-PPase蛋白表达并且其 活性明显增大。 3.同时过量表达盐地碱蓬液泡膜Nd/H”antiporter基因SsNHX与拟南芥液泡 膜 H”-PPase基因 A rpl对拟南芥耐盐性的影响 同时过量表达盐地碱蓬N//H”逆向转运蛋白基因SsNHX!及拟南芥液泡膜焦磷 酸酶基因AVPI 的拟南芥植株比野生型拟南芥植株具有更强的抗盐能力。 在不含NaCI的MS培养基上,转基因植株的生长与野生型植株没有明显差异,说明 外源基因的插入


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