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盐胁迫下盐地碱蓬叶片V-H~+-ATPase H亚基的克隆与表达分析

李艳艳  
【摘要】:盐分胁迫主要包括渗透胁迫及离子胁迫。渗透胁迫、离子胁迫及其造成的一系列次级胁迫如氧化胁迫等,严重干扰植物体内业已存在的细胞及整株水平上的水分及离子稳态,造成植物细胞分子损伤,生长减缓甚至死亡。因而植物对抗盐胁迫的一个重要策略是在高盐环境下重建体内的稳态(homeostasis),包括重建离子稳态(ionic homeostasis)和渗透稳态(osmotic homeostasis)等。本实验以典型的积盐型盐生植物盐地碱蓬为材料,探讨了盐对盐地碱蓬V-H+-ATPase H亚基基因及蛋白表达的影响,分析了V-H+-ATPase对液泡Na+区隔化的作用;构建了含有V-H+-ATPase H亚基基因ssVHA-H的植物表达载体并转化拟南芥,分析了过量表达V-H+-ATPase H亚基基因对拟南芥耐盐性的影响,主要实验结果如下: 1. NaCl胁迫对盐地碱蓬V-H+-ATPase B、H、c亚基基因表达及V-H+-ATPase活性的影响 Northern分析表明盐胁迫明显诱导了盐地碱蓬V-H+-ATPase B、H、c亚基基因转录。400 mmol/L NaCl处理盐地碱蓬植株0-120 h发现盐胁迫明显诱导了盐地碱蓬V-H+-ATPase H亚基基因表达;100、400 mmol/L NaCl处理盐地碱蓬植株,分析其叶片V-H+-ATPase亚基基因表达也发现盐胁迫明显诱导了盐地碱蓬V-H+-ATPase B、H、c亚基基因表达并且其表达量随盐处理浓度的增加而增大。V-H+-ATPase B、H亚基位于H+-ATPase V1区而c亚基位于H+-ATPase V0区,三者基因表达均为盐胁迫所诱导,证明盐胁迫下盐地碱蓬V-H+-ATPase B、H、c亚基基因表达存在协同作用。 用GST-SsVHA-H?4-206免疫家兔制备了盐地碱蓬液泡膜V-H+-ATPase H亚基多克隆抗体。200 mmol/L NaCl处理盐地碱蓬植株分离其叶片液泡膜微囊进行Western-blot分析发现盐胁迫明显诱导了盐地碱蓬V-H+-ATPase B、H、c亚基蛋白的表达,证明盐胁迫下盐地碱蓬V-H+-ATPase各亚基在翻译水平存在协同表达。100、400 mmol/L NaCl处理亦明显增加了盐地碱蓬叶片液泡膜微囊H+-ATPase活性,表明盐胁迫下,盐地碱蓬V-H+-ATPase各亚基在转录、翻译水平的协同表达增加了H+-ATPase全酶的数量,进而增大了H+-ATPase的活性。 2.过量表达盐地碱蓬液泡膜V-H+-ATPase H亚基基因对拟南芥耐盐性的影响 过量表达盐地碱蓬V-H+-ATPase H亚基基因的转基因型拟南芥植株比野生型具有较好的抗盐能力。在不含盐的MS培养基上,转基因植株的生长与野生型植


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