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盐芥ThTRXh蛋白的亚细胞定位及AtTRXh突变体的表型分析

齐兴云  
【摘要】:硫氧还蛋白是一类广泛存于原核生物和真核生物的热稳定、酸性小分子量蛋白质(其分子量约为12Kda)。该蛋白质中含有保守的-CP(G)PC-氨基酸活性基序,其中的两个半胱氨酸残基可通过巯基/二硫键的转换实现其氧化还原状态的变化和电子/氢的传递,对细胞中与氧化还原相关的多种生理过程的调节起重要作用,是重要的氧化还原调节蛋白。 高等植物拥有复杂的硫氧还蛋白系统,它们广泛分布在细胞质、叶绿体和线粒体中,这为它们参与调控多种生命活动提供了便利。存在于叶绿体中的硫氧还蛋白参与光合作用中的电子传递过程,而存在于细胞质中的硫氧还蛋白可能参与细胞的氧化还原调节。由于氧化胁迫是普遍发生于植物胁迫过程中的生理现象,它会改变植物正常生理代谢所依赖的植物体内稳定的氧化还原内环境,导致对细胞的直接损伤,影响植物的正常代谢生长,从而导致许多生物或非生物的严重胁迫状态,严重时甚至导致植株死亡。盐芥是一种与拟南芥近缘的十字花科植物,具有很多与拟南芥相同的优点:如类似的形态、小的基因组、短的生活史、丰富的种子和易于被转化等。但是,盐芥对多种胁迫的耐受能力远远高于拟南芥,它在短时间内能耐受高达500mMNaCl的冲击,在盐适应前后既不产生盐腺也没有复杂的形态上的变化。因此,对盐芥硫氧还蛋白的功能研究对于研究植物氧化性伤害的产生和应答机制,对了解植物胁迫状态下的代谢变化和代谢调节,揭示植物的耐逆机理都具有重要意义。 本实验室在盐芥EST库中得到ThTRXh基因,并通过体外表达及活性实验证明该硫氧还蛋白确实具有TRX h的活性。TRXh基因家族蛋白成员主要存在于植物细胞质中,但也存在于内质网、线粒体中,不同的定位与其相应的功能相关。为了解ThTRXh的生物学功能,我们首先构建了ThTRXh-EGFP融合基因瞬时表达载体,并用PEG法转化拟南芥叶肉原生质体,通过共聚焦显微镜检测对ThTRXh进行了初步的亚细胞定位。同时构建了ThTRXh的GFP植物双元表达载体,并对洋葱表皮进行了农杆菌介导的转化,通过共聚焦显微镜检测对ThTRXh进行了进一步的亚细胞定位。无论是拟南芥叶肉原生质体的瞬时表达实验还是洋葱表皮的农杆菌转化实验都表明ThTRXh定位于细胞质中,这与软件分析的结果相一致。然后我们订购了ThTRXh同源基因的拟南芥突变体,并对其进行了表型检测,为下一步做ThTRXh的表型互补实验奠定一定的基础。我们的结果显示突变体萌发率明显低于野生型,但是早期生长较野生型要好,根长的生长率也好于野生型,而叶片H2O2的直接定位结果表明与野生型相比,突变体比野生型积累了更多的H2O2,受到的氧化胁迫更为严重,这说明硫氧还蛋白参与种子的萌发和早期生长,它可能作为一种信号分子参与植物体对氧化胁迫的应答。


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