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用RNA干涉技术研究MAD2在小鼠卵母细胞减数分裂成熟中的作用

王建英  
【摘要】: 蛋白激酶在减数分裂和受精过程中的作用,是当前生殖和发育生物学的研究热点之一。现在人们已经认识到:多种蛋白激酶的级联活化以及对胞内效应靶分子的磷酸化修饰,精密调节着卵子成熟和受精等特殊的细胞周期事件。如何用一种简便实用的方法研究众多的、错综复杂的蛋白激酶网络,已成为当前首要的任务。RNA干涉(RNA interference,RNAi)是一种新的基因敲除技术,与其它基因敲除技术相比,RNA干涉技术操作相对简便,结果出来快速。在后基因组时代,需要大规模、高通量地研究基因的功能。如何寻找一种简单、方便而又高效的工具,是一项摆在我们面前的迫在眉睫的任务。由于RNA干涉能高效特异地阻断基因的表达,利用该技术可以实现在特定时期针对特定组织细胞对目的基因进行阻抑,它有可能成为研究信号传导通路的新途径,使精确研究信号转导、基因表达的调控机理成为可能。 纺锤体检验点蛋白通过抑制后期促进复合物或cyclosome (APC/C)的泛素连接酶活性,控制从中期到后期的关键转换和染色体的正确分离。纺锤体检验点的信号通路包括:主要成分(MAD1、MAD2、MAD3/BUBR1、BUB1、BUB3和MPS1),动粒蛋白(NDC80复合物、ROD/ZW10、AME1和OKP1),微管马达(CENP-E、DYNEIN和MCAK/XKCM1),效应器(CDC20、CDH1和APC/C)和其他组分(Ipl1/Aurora激酶、Survivin、APC蛋白、MAPK、CMT2、Polo-like激酶、组蛋白和P53)。这些蛋白形成一个复杂的细胞内信号网络来抑制APC/C,它们的缺失能够导致遗传物质的不稳定性甚至形成癌变,因此这些蛋白的研究引起越来越多科学工作者的关注。尽管其他检验点蛋白,例如BUBR1,也参与APC/C的活化和失活,但大多数人认为与CDC20或p55CDC结合的MAD2则是参与APC(CDC20)活化与失活最直接的蛋白。本论文旨在通过RNA干涉技术研究MAD2在小鼠卵母细胞减数分裂成熟中的作用。 研究目的:建立检测MAD2 mRNA表达的实时荧光定量PCR的方法,并应用SYBR GreenⅠ染料法分析小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中MAD2 mRNA表达的动态变化。在本实验中我们应用MAD2 siRNA转染的方法研究MAD2在体外小鼠卵母细胞减数分裂成熟中的作用。 研究方法:采用实时荧光定量PCR方法,以SYBR GreenⅠ为荧光染料,管家基因β-ACTIN为内参,梯度稀释的重组质粒为模板制作标准曲线,并以此方法分析了小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中MAD2 mRNA表达的动态变化。通过阳离子脂质体转染的方法将化学合成的MAD2 siRNA转染到小鼠卵母细胞中去,分别用实时荧光定量PCR和激光共聚焦显微技术检测MAD2基因和蛋白水平的变化,结合卵母细胞形态学和细胞凋亡的方法分析MAD2在体外小鼠卵母细胞减数分裂成熟中的作用。 结果:建立了分析小鼠卵母细胞中MAD2 mRNA表达的实时荧光定量检测方法,本法灵敏度高、特异性强,扩增效率接近100%。实时荧光定量PCR分析小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中MAD2 mRNA的表达存在动态变化。实时荧光定量PCR和激光扫描共聚焦显微镜技术表明我们通过RNA干涉技术成功地下调了MAD2基因和蛋白的表达水平。进一步的研究发现MAD2下调导致第一次减数分裂周期的缩短和减数分裂纺锤体的异常,说明MAD2在小鼠卵母细胞减数分裂成熟中起一定的作用。我们还发现MAD2的RNA干涉在一定程度上降低了卵母细胞GVBD的比例。 结论及意义:我们的研究表明实时荧光定量PCR是检测基因mRNA表达水平的理想选择,siRNA转染是研究MAD2功能的一种有效手段,我们的结果进一步验证了MAD2做为一种纺锤体检验点蛋白在小鼠卵母细胞中的作用。我们将RNA干涉技术与细胞凋亡、实时荧光定量PCR、激光共聚焦显微术等技术相结合,探索了一条技术先进、方法可行的研究蛋白激酶及其底物分子的方法,为卵子信号转导研究奠定坚实的基础,同时使RNA干涉技术的应用达到国际先进水平,从而占领哺乳动物卵母细胞减数分裂和受精研究的制高点,对于促进生殖生物学的发展具有一定意义。


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