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《山东师范大学》 2007年
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用于细胞内活性氧自由基检测的远可见、近红外荧光探针的设计合成及应用研究

徐克花  
【摘要】: 生物体内活性氧自由基水平直接与生物的生理、病理相关,高选择性识别与定量自由基是研究自由基参与生命活动机制的前提。本文以荧光素、萘荧光素为荧光发色团,基于非氧化机理,设计合成了系列远可见、近红外荧光分子探针,实现了细胞内超氧阴离子自由基及过氧化氢的检测及可视化成像;将荧光素系列探针与萘荧光素系列探针优化组合,筛选出互不干扰的两种探针用于超氧阴离子自由基及过氧化氢的同时检测,首次实现同一体系中两种自由基的同时分别定量。 本论文主要内容如下: 1、基于超氧阴离子自由基的亲核性,我们设计合成了一种用于识别超氧阴离子自由基的新型荧光探针—双(二苯基次膦酰基)荧光素(FP-1),并通过元素分析,红外,核磁共振及质谱对探针结构进行表征,建立了测定O2-·的普通荧光法。探针试剂本身没有荧光,与O2-·反应后荧光显著增强,激发和发射波长分别位于490 nm和530 nm。该探针能高选择性地捕获O2-·,而同倍共存的其它活性氧(ROS)及一些生物样品中常存在的还原性化合物不干扰。该方法在两段O2-·浓度范围内,1×10-10~1×10-8 mol l-1和1×10-6~8×10-6 mol l-1,与荧光增强呈现良好的线性关系,最低检测限为4.6 pM,具有很高的灵敏度。利用激光共聚焦成像技术对探针孵育的正常巨噬细胞、PMA刺激的巨噬细胞及Tiron试剂处理的巨噬细胞荧光成像,照片显示探针对微摩尔级的O2-·产生响应。实验表明该荧光探针对于O2-·的识别与检测具有选择性好、灵敏度高、水溶性好及生物兼容性等优点,且可实现细胞内O2-·的可视化示踪。研究结果将为植物体内超氧阴离子自由基的检测及生理、病理研究提供实用可靠的探针及实验方法。 2、设计合成了一种新型红色荧光探针—双(二苯基次膦酰基)萘荧光素(PNF-1),用于检测细胞内超氧阴离子自由基。该探针是基于O2-·的强亲核性促使分子中次膦酸酯迅速水解生成荧光性化合物-萘荧光素来检测超氧的,其荧光发射谱位于662 nm处,能有效避免细胞自发荧光的干扰,提高了检测的选择性和灵敏度。实验方法的最佳条件及线性范围被获得,检测限为0.1 nM,具有很高的灵敏度。共聚焦细胞成像显示探针可以对细胞内纳摩尔级的O2-·产生响应(RAW 264.7)。结果显示该荧光探针对于O2-·的识别与检测具有选择性好、灵敏度高、膜渗透性好等优点,可实现O2-·的可视化示踪,对于活性氧的研究具有重要意义。 3、设计合成了一种有效用于水相中检测超氧阴离子自由基的新型红色荧光探针—双(二苯基次膦酰基)-5(6)-羧基萘荧光素,用元素分析、红外、核磁共振等手段对探针结构进行了表征,建立了测定水相中O2-·的普通荧光法。探针试剂本身无荧光,经O2-·亲核性水解次膦酯产生强荧光产物-5(6)-羧基萘荧光素,激发和发射波长分别位于588nm和667nm。该探针高选择性捕获O2-·,同倍共存的其它活性氧(ROS)不干扰。该方法线性范围1.0×10-7~1.0×10-5mol l-1,检出限为0.25 nM,具有良好的灵敏度 4、基于H2O2能特异性催化水解磺酸酯,我们创新性地设计合成了两种新型近红外荧光探针-双(对甲苯磺酰基)萘荧光素(NFDS-1)和双(全氟辛烷磺酰基)萘荧光素(NFDS-2),用于细胞内过氧化氢的检测。探针试剂本身没有荧光,与过氧化氢反应后产生荧光产物萘荧光素,激发和发射波长分别为602/692 nm,位于近红外区,有效避免了细胞自发荧光的背景干扰。实验表明,脂溶性探针NFDS-1具有良好的膜穿透性,可选择性捕获细胞内的过氧化氢,并且可以对细胞内纳摩尔级过氧化氢含量的变化产生响应。尽管NFDS-1的水溶性欠佳,但在二甲基亚砜促溶下,仍然可以有效进行水相中过氧化氢的检测。方法的线性范围为6.0×10-9~4.0×10-6 mol l-1,检测限为81.5 pM。研究结果将为植物体内过氧化氢的检测及信号转导研究提供实用可靠的探针及实验方法。 5、本文设计合成了新型绿色荧光探针-双(对甲苯磺酸酯基)荧光素(FS-1)和双(对甲苯磺酸酯基)-二氯荧光素(FS-2),用于检测细胞内过氧化氢。检测原理是基于H2O2能特异性催化水解磺酸酯,给出荧光产物荧光素。实验表明,探针FS-1和FS-2在模拟生物体系中检测过氧化氢,具有良好的选择性和灵敏度,且线性范围宽。其它种类活性氧和一些生物体内存在的还原性化合物,包括O2.-,.OH,NO,ONOO-,对苯二酚,谷胱甘肽和酯酶等基本不干扰。细胞成像实验表明,探针FS-1和FS-2用于PMA刺激或外加不同浓度H2O2孵育的小鼠腹膜巨噬细胞均呈现明亮的绿色荧光,且能对细胞内微摩尔级H2O2浓度变化产生响应。证明两探针均具有良好的膜渗透性、高的选择性及良好的灵敏度。 6、利用双(对甲苯磺酸酯基)萘荧光素及双(二苯基次膦酰基)荧光素联合测定肺纤维化鼠的胸腔灌洗液的上清液及巨噬细胞内过氧化氢和超氧阴离子自由基的量,以及肺组织细胞中该两种自由基的同时定量,定性给出了肺纤维化程度与自由基量的关系。
【学位授予单位】:山东师范大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q2-3

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【参考文献】
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【共引文献】
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