鸡贫血病毒VP1基因的克隆、原核表达纯化以及多克隆抗体的制备

【摘要】： 鸡贫血病毒(chicken anemia virus, CAV)是鸡传染性贫血病( Chicken infectious anemia, CIA )的病原。CAV基因组共含有三个开放读码框,分别编码VP1(51.6KD), VP2(24.0KD)和VP3(13.6KD)三种蛋白。其中VP1蛋白是CAV的唯一衣壳蛋白,而VP2是VP1的辅助蛋白,能帮助VP1形成正确的构象,二者相互协调才能诱导机体产生免疫保护作用。VP3,也称调亡素,能引起细胞凋亡,与CAV的致病性有关。 本课题第一部分在获得CAV全基因组的基础上,首先根据Genbank中CAV哈尔滨分离株基因组序列,设计出针对CAV VP1全长的引物和CAV VP1小片段(608bp)的引物,利用PCR方法从实验室前期构建好并测序正确的pUC18-CAV质粒中扩增出VP1基因全长和VP1小片段(608bp),各自双酶切后将全长和小片段基因按照正确的读码框克隆到原核表达载体pET 28a(+)、pET41a(+)和pET32a(+)上,得到含VP1基因全长的pET28a(+)重组子和含VP1小片段的pET28a(+)、pET41a(+)和pET32a(+)重组子,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,并对经抗生素初步筛选的重组子进行双酶切鉴定和序列鉴定。将双酶切鉴定正确并且测序结果与Genbank上VP1基因序列完全一致的阳性重组质粒转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3),28-37℃、1mMIPTG诱导重组蛋白表达。经SDS-PAGE和Western blotting检测后发现含VP1基因全长和VP1小片段的pET28a(+)、pET41a(+)重组子诱导菌无明显融合蛋白表达,而含VP1基因小片段的pET32a(+)重组子诱导菌有分子量约42kDa的融合蛋白表达,与预期分子量大小一致,并且表达蛋白大部分以包涵体形式存在。 利用目的蛋白的多聚组氨酸尾巴进行镊柱亲和层析纯化融合蛋白,经Western blotting鉴定,融合蛋白与His单抗能够结合。纯化出的蛋白经PBS透析后浓缩,进行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色后切胶。将切下含目的蛋白的胶用PBS溶解研成匀浆后液氮冻融三次,与佐剂乳化制备抗原免疫动物,以收获抗血清,并利用得到的抗血清进行梯度稀释作为一抗做蛋白质印迹。利用经1:200比例稀释的抗血清作为一抗做的蛋白质印迹的结果显示,在PVDF膜上特异性的显示出了分子量约为42KD的蛋白条带。 综上所述,重组质粒pET32a(+)-VP1’(608bp)能够成功地在大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中表达出目的蛋白,而其它构建的重组子未见明显表达。所获得的重组质粒pET32a(+)-VP1’表达的融合蛋白与预期大小相同。利用亲和层析纯化后的蛋白制备抗原,免疫动物获得抗血清。 通过本课题第一部分的实验,为后续制备单克隆抗体进而更精确的检测鸡传染性贫血病提供了良好的抗原来源,也为研究VP1与其他CAV蛋白之间的相互关系奠定了基础。 另外,本课题的第二部分着重研究了鸡贫血病毒间的同源重组。CAV的遗传变异性是极其有限的,同源重组是CAV进化的重要机制之一。因此研究清楚CAV间是否存在着同源重组、同源重组在CAV进化上有什么作用,是非常重要的。我们从Genbank中挑选了来自世界各地分离出的CAV全基因组序列共31个,对它们进行系统发生的分析,构建系统进化树,并使用SimPlot软件推断出疑似的重组序列,然后用bootscaning的方法来确定这些序列中是否真的存在同源重组。经过上述研究我们首次发现了CAV的一个新的基因型,并且找到了序列AF999018可能的亲本序列DQ124936和DQ141672。这意味着同源重组在CAV自然群体的遗传多样性上发挥着相当重要的作用。