盐芥和拟南芥硫氧还蛋白在氧化胁迫中的功能研究

【摘要】： 植物在生活史中不可避免的要遭受盐、干旱、低温等胁迫,在初期阶段会造成植物体离子失衡和渗透紊乱,胁迫的延续或加重常会伴随ROS的产生和次生性氧化胁迫的发生,最终导致植物生长缓慢,产量降低。生物体可通过多种调节方式和调节途径对生物体的氧化还原状态进行调节,与硫氧还蛋白相关的氧化还原调节是这些调节方式中的一种。 硫氧还蛋白(Thioredoxin, TRX)是一类低分子量、热稳定、酸性蛋白,广泛存于原核生物和真核生物(包括动物、植物、细菌和古细菌等)中,其分子量约12 kDa;蛋白质分子中含有保守的WCG(P)PC活性序列位点,该序列中的两个半胱氨酸残基可构成具有氧化还原活性的二硫桥,通过巯基/二硫键的转换实现其氧化还原状态的变化和电子/氢的传递,参与生物体的氧化还原调节。植物体中的Trx最初是在叶绿体中发现的,被认为是光合作用中一些关键酶的活化调节蛋白,后来在细胞质和线粒体中也发现了硫氧还蛋白,它们在结构和功能上都有所差异.自发现硫氧还蛋白以来的几十年里,人们对它的种类、特点、功能等方面有了越来越多的认识,为更好地利用它奠定了必要的基础。 盐芥是一种与拟南芥近缘的十字花科植物,具有很多与拟南芥相同的优点:如类似的形态、小的基因组、短的生活史、丰富的种子和易于被转化等。但是,盐芥对多种胁迫的耐受能力远远高于拟南芥,它在短时间内能耐受高达500mMNaCl的冲击,在盐适应前后既不产生盐腺也没有复杂的形态上的变化。因此,对盐芥硫氧还蛋白的功能研究对于研究植物氧化性伤害的产生和应答机制,对了解植物胁迫状态下的代谢变化和代谢调节,揭示植物的耐逆机理都具有重要意义。 TRXh基因家族蛋白成员主要存在于植物细胞质中,但也存在于内质网、线粒体中,不同的定位与其相应的功能相关。为了解ThTRXh的生物学功能,我们首先构建了ThTRXh-GST融合基因表达载体,转化至DE3大肠杆菌,完成ThTRXh-GST融合蛋白的表达,为下一步研究盐芥硫氧还蛋白同靶蛋白的互作提供了条件。然后构建了ThTRXh-EGFP融合基因植物表达载体,并用花侵染法转化拟南芥,不同的盐、氧化胁迫对转基因株系处理一段时间后,通过激光共聚焦显微镜检测不同胁迫对ThTRXh亚细胞定位的影响。结果表明无论在胁迫条件下还是对照实验中,ThTRXh都定位于细胞质中,定位并未发生改变。然后我们订购了ThTRXh同源基因的拟南芥突变体,对拟南芥硫氧还蛋白突变体和转ThTRXh基因株系进行胁迫耐受性分析,为下一步做ThTRXh的表型互补实验奠定一定的基础。我们的结果显示拟南芥硫氧还蛋白突变体萌发率明显低于野生型,转ThTRXh基因株系萌发率高于野生型,这说明硫氧还蛋白参与种子的萌发,它可能作为一种信号分子参与植物体对氧化胁迫的应答。