番茄WRKY基因克隆及分析

【摘要】： 植物采用多种机制对生物和非生物逆境做出适应性反应。在植物与环境的相互作用研究中,人们越来越关注植物基因在转录水平上的调控,对转录因子的研究已成为现今植物基因研究的一个重点。当植物受到外界环境刺激后,其体内会通过一系列信号传递,最终诱导植物防卫反应相关基因的表达,在此过程中,转录因子起着极其重要的作用。在植物中,现已发现MYB、bHLH蛋白、MADS域蛋白、WRKY锌指蛋白、AP2域蛋白、bZIP蛋白等多种转录因子。在众多的转录因子中,WRKY转录因子便是近年来发现的一种新型转录调控因子,因其在N端含有由WRKYGQK组成的高度保守的氨基酸序列而得名,在保守结构域的下游含有一种只存在于植物转录因子中的特殊的锌指基序。WRKY基因在植物体内会受外界环境的激发而诱导表达,具有快速、瞬时和组织特异性表达等特点,并参与生物和非生物胁迫应答反应。各种高等植物当机体受到病原物侵害时,WRKY基因就能快速且大量的表达。WRKY转录因子在植物防卫反应、植物生长发育、植物代谢以及信号转导中起调控作用。此外,一些WRKY蛋白还具有自我调控的能力。目前虽然对拟南芥、烟草及水稻中的WRKY基因研究较多,但迄今为止有关番茄WRKY转录因子的报道却很少。本实验拟在番茄中获得和抗病相关的WRKY基因,为番茄抗病育种奠定基础。 本研究以番茄苗为实验材料,根据笔者课题组已经克隆出的番茄特异的WRKY基因片段和番茄EST序列设计特异引物,利用RT-PCR技术从100μM JA处理的番茄苗中克隆得到WRKY转录因子的部分cDNA序列,再利用RACE技术克隆获得3'cDNA序列,长1028 bp,编码187个氨基酸;5'cDNA序列,长823 bp。将获得的序列连接到pMD19-T载体中,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,用双酶切分析法对其进行鉴定并进一步对核酸序列进行测序分析。将3'cDNA序列和5'cDNA序列进行全序列拼接,并对其进行相关的生物信息学分析。结果表明,该基因全长为1740bp,最长的开放阅读框为1083bp,编码360个氨基酸,含有一个WRKYGQK保守结构域及C2H2锌指基序,因此可初步推断该基因属于WRKY第ΙΙ家族成员。Blastn序列分析表明,该基因与FJ654265.1 ( E:0.0)、AK329773.1(E:0.0)、FJ654264.1(E:0.0)、EU755370.2(E:0.0)、AY789641.1(E:0.0)、AB028022.1(E:0.0)的相似性分别是91%、88%、85%、86%、80%、69%,这也表明所克隆的基因属于WRKY基因家族。 利用相关软件对所克隆的WRKY基因进行蛋白质结构分析及初步的功能预测。结果表明,WRKY蛋白的分子量为39.77 KD,理论等电点pI值为8.57。二级结构分析表明该蛋白中α螺旋占28.55%,β折叠占21.80%,无规卷曲占49.65%。对该蛋白进行跨膜分析,结果表明该蛋白无跨膜螺旋区,不是膜蛋白。此外对其进行分析未发现信号肽,初步断定其不是分泌型蛋白。 本实验利用Real-time PCR的方法对番茄WRKY基因的表达模式进行了初步的探索,通过研究番茄WRKY基因在不同胁迫下的表达情况,了解该基因在逆境下的表达规律,并以此来初步推断该基因可能参与的防卫信号途径。结果表明,番茄WRKY基因在JA(100μM)、SA(1mM)、NaC(l100mM)、4℃一系列非生物逆境条件下均有表达,且在JA(100μM)处理12h后表达量有明显增高的趋势。此外,为了研究该基因对番茄生长发育的影响,分别对根、茎、叶中WRKY基因的表达情况进行了探索,结果表明该基因在根、茎、叶中均有表达,且在叶中的表达量最多,其次为根,在茎中的表达量最少。这表明番茄WRKY基因可能参与调控番茄对逆境的防卫反应以及番茄的生长发育。