大田软海绵酸（Okadaic Acid，OA）对小鼠胚胎细胞3T3的影响

【摘要】：研究背景和研究目的： 在海洋中大约有300种的藻类可以引起赤潮,其中有80种左右可产生毒素。这些毒素可以通过鱼类、贝类等海洋生物的富集传递作用引起人类中毒,对人类健康形成了潜在威胁。因此许多国家都建立了赤潮检测体系,并对赤潮藻毒素的毒性作用机制及检测方法做了一系列的研究,取得了重大进展。 然而,迄今为止,对于利马原甲藻等有害赤潮藻所产生等藻毒素对于小鼠细胞的细胞内部结构、增殖和凋亡的的影响的研究还很少,且对于对有害藻类的研究主要集中在淡水蓝藻,其余藻类涉及的较少。因此,我们有必要对有害赤潮藻对于哺乳动物细胞的影响进行全面的研究。为在细胞水平上提供对赤潮藻毒素毒性的检测以及对赤潮的危害的预报上提供更为准确的数据。 研究方法： 1.MTT及细胞计数法检测细胞存活率,检测不同浓度OA对细胞数量的影响,对OA毒性强度进行初步确定。 2.细胞凋亡情况的检测： —倒置相差显微镜观察细胞形态变化； —吖啶橙(AO)荧光染色,结合激光共聚焦显微镜观察进一步检测细胞凋亡形态变化； —活性氧(ROS)含量测定,用荧光分光光度计检测细胞内活性氧的含量； —中性红染色,倒置显微镜观察细胞中性红的摄入量以检测细胞凋亡中细胞膜活性变化； —乳酸脱氢酶(LDH)含量检测,用乳酸脱氢酶试剂盒结合紫外分光光度计检测细胞内LDH含量的变化； 3.细胞周期影响的检测： —流式细胞技术检测OA对细胞周期的影响。 4.OA对caspase-3激活情况的检测：用caspase-3活性检测试剂盒分析细胞内caspase-3酶活性变化； 研究结果： 1.OA及利马原甲藻提取物对小鼠胚胎细胞3T3细胞增殖的影响 结果显示：当藻浓度在0.2×103cells//ml时,藻类提取液对细胞抑制较弱。随着藻浓度增大,藻类提取液对细胞增殖的抑制程度逐渐增加,且与时间呈正相关。OA可以显著抑制3T3细胞的生长,且对3T3细胞的增殖抑制效应呈现出明显的剂量依赖性,即随药物浓度的提高,细胞存活率逐渐下降。 2.OA对3T3细胞的内外部形态影响—倒置相差显微镜观察细胞形态变化结果表明：经10ng/mLOA处理后,细胞部分变圆,边缘皱缩并有细胞膜发泡现象；暴露于50ng/mL的细胞绝大部分失去梭形形状,细胞相互分离边缘,可以见到由细胞膜包裹的凋亡小体；而暴露于100ng/mL的细胞凋亡小体明显可见并出现不同程度的破裂 —吖啶橙(AO)染色结合荧光显微镜检测染色质凝集结果 结果显示：OA作用后,细胞染色增强,荧光更为明亮,染色质呈固缩状或圆珠状(早期凋亡)；随着OA浓度增加,细胞和染色质呈固缩状或圆珠状,呈典型的细胞凋亡的特征 3. OA对3T3细胞膜透性的影响 —中性红染色实验 结果显示：50ng/ml和100ng/ml的OA分别处理3T3细胞48小时,与对照组相比,实验组细胞摄入中性红的量明显增加,并伴有细胞体积变小固缩、胞质内空泡化明显。这说明,随着OA浓度增加,细胞膜的通透性增加。 —LDH检测细胞膜完整性 结果显示：50ng/ml和100ng/ml的OA分别处理3T3细胞48小时,与对照组相比,实验组培养液中LDH酶活性与对照组相比变化显著(p0.05,n=3)。这表明,高浓度处理组中细胞出现了坏死的现象。 4. OA对3T3细胞凋亡的影响 一细胞内活性氧水平的检测 结果显示：检测结果显示：3T3细胞经OA处理48小时,引起3T3细胞内ROS得大量产生和聚集。与OA对照组相比,50ng/mlOA处理组ROS的水平从4.408升高至9.079,增加了2.05倍,而经过100ng/mlOA处理后,ROS水平再次上升为22.6,增长了5.12倍。 —Caspase-3酶活性的检测 结果显示：Caspase-3酶活检测试剂盒检测分析发现：50ng/ml的OA处理3T3细胞48小时后,与对照组相比,405nm处光吸收值由0.0425上升至0.133,活性上调了2.9倍； —流式细胞仪检测细胞周期分布结果显示：OA可诱导3T3细胞凋亡并将其细胞周期阻滞于G1期使细胞不能进入S期。

【关键词】：赤潮藻毒素 3T3细胞 细胞凋亡 细胞增殖 细胞周期 caspase-3
【学位授予单位】：曲阜师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：Q949.98
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