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《曲阜师范大学》 2012年
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热纤梭菌纤维素内切葡聚糖酶在酿酒酵母细胞表面上的展示及其性质研究

谭静利  
【摘要】:纤维素是一种可再生资源,且是地球上数量最大的。但是由于纤维素具有木质素外被以及水不溶性的高结晶结构,所以纤维素被水解为可利用的小分子葡萄糖是相当困难的。这也就导致了纤维素的利用率极低。而纤维素酶是能够将纤维素水解为葡萄糖的一组酶的总称,包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。但是纤维素酶的生产成本高且活性很低,这两个限制纤维素应用的瓶颈问题成为纤维素研究的热点与难点。随着基因工程技术的发展,采用不同的表达载体进行重组蛋白的表达,使得这一难题得到缓解。 对本实验室保存的一株产纤维素内切葡聚糖酶的厌氧热纤梭菌进行研究,首先提取基因组总DNA,根据热纤梭菌纤维素内切葡聚糖酶基因序列和酿酒酵母细胞表面展示质粒载体pYD1上的多克隆位点设计引物并进行PCR扩增,连接到载体并转化入大肠杆菌宿主细胞,筛选后进行序列测定及比对。然后将该基因连接到表面展示质粒载体pYD1上,并转化用于表面展示酿酒酵母EBY100菌株中,挑选阳性转化子,经酵母菌落PCR证实纤维素内切葡聚糖酶基因已成功整合到酵母基因组中。接着,用2%的半乳糖进行诱导表达,后用刚果红平板法对诱导表达的结果进行初步鉴定,重组酶点种后平板出现透明圈。最后用DNS法测其表面展示酶的酶活及其性质研究。 通过对表面展示的纤维素内切葡聚糖酶的酶学性质研究,发现此酶的最适反应温度是50℃,同时在pH4.6时该表达产物具有较高的酶活;最适反应时间为10min,用2%的半乳糖诱导表达60h后酶活达到最高,为32IU/ml,较天然酶有很大提高;在4℃储存时有较好的稳定性。同时还研究了金属离子对重组酶酶活性的影响,结果显示不同的金属离子对酶活的影响不同,同种金属离子在不同的浓度下对酶活的影响也不同。
【学位授予单位】:曲阜师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:Q78

【参考文献】
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