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泰山虫草资源多基因分子系统学研究

王波  
【摘要】: 虫草属(Cordyceps)隶属子囊菌门(Ascomycota)、核菌纲(Pyrenomucetes)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Clavicipttaceae),广布于全世界。一般认为该属拥有400多种,我国现有记载139个名称。山东省内记载3种,泰山虫草、蛹虫草、大团囊虫草白化变型。 以泰山虫草子实体分离出的3个菌株以及4株虫草的有性型为实验材料,采用分子生物学手段,对虫草rDNA ITS区、18S及28S基因序列进行比较分析,从基因水平证明虫草的无性型,探讨泰山虫草有性阶段可能的系统发育关系,以期为虫草资源的开发和利用提供理论依据。主要内容如下: 1.根据White等人所设计的虫草属真菌通用引物,以形态差异较明显的4株虫草及3个菌株的基因组DNA为模板,通过PCR技术分别扩增出核糖体DNA的全长ITS序列(包括ITS1和ITS2)、18S和28S部分序列,并对相关目的片段进行回收、克隆和测序分析。结果表明,ITS序列长567~587 bp,18S rDNA序列长372 bp,28S rDNA序列长925~928 bp。 2.三株虫草分离物COA1、COA2和COA3的全长ITS区分别为528 bp、530 bp、548bp。序列比对发现,分离物COA1的ITS序列与蛹草拟青霉Paecilomyces militaris ITS、分离物COA2与球孢白僵菌Beauveria bassiana ITS、分离物COA3与细脚拟青霉(大孢虫花)Paecilomyces tenuipes ITS都只有1个碱基的差异,相似性高达99%。这说明COA1与Paecilomyces militaris、COA2与Beauveria bassiana、COA3与Paecilomyces tenuipes彼此间在基因水平上是高度一致的。为了进一步比较虫草分离物无性型与拟青霉属(Paecilomyces Bainie)、白僵菌属(Beauveria Vuill)之间的关系,以冬虫夏草C.sinenses做外群,与同源性较高的相关菌物构建分子系统树。结果表明:COA1的无性型可能为蛹草拟青霉,COA2的无性型可能为球孢白僵菌,COA3的无性型可能为细脚拟青霉(大孢虫花)。 3.对各株虫草的ITS区和18S、28S rDNA部分序列分别进行单基因系统进化分析。综合rDNA ITS区同源性比较、遗传距离分析、系统发育树的位置,本研究所采集的虫草大致分为3个分支:KY与COA1、COA4、COA5、COA6构成第一分支,彼此之间的遗传距离最小,仅为0.005,即ITS区序列差异为0.5%,说明KY与COA1、COA4、COA5、COA6之间的ITS区序列具有较大的一致性,意味着在系统发育上有近缘的关系;而COA2及COA3单独形成第二和第三分支。18S rDNA序列的最大简约法(MP)系统发育与根据ITS区序列构建的MP树在第一个分支上基本相似,只是COA1从这一分支中分离出来。在第二分支上,COA2、COA3和C.takaomontana聚在一起,布氏虫草(C.brongniartii)、球孢虫草(C.bassiana)单独聚为一支。但18S rDNA序列的MP系统发育分析支持KY与COA4、COA5、COA6、蛹虫草组成一个亲缘关系较近的类群;28S rDNA序列的MP分析结果同样支持KY与COA4、COA5、COA6、C.militaris、C.roseostromata构成一个分支,其中KY与COA4遗传距离为0.005,与其他成员两两比较其遗传距离均小于0.005,即碱基序列差异小于0.5%,说明在DNA水平上具有较大的一致性。COA3与高雄山虫草(C.takaomontana)的亲缘关系在3个基因的MP树中得以充分体现。 以最大简约法合并分析ITS区、18S、28S rDNA基因片段,所得数据支持COA4、COA5、COA6、蛹虫草(C.militaris)、红座虫草(C.roseostromata)、KY构成一个分支,与COA1构成姐妹群,然后与COA3、高雄山虫草(C.takaomontana)聚合的分支构成姐妹群,之后与COA2、布氏虫草(C.brongniartii)、球孢虫草(C.bassiana)聚合的分支构成姐妹群。这与根据ITS序列独立分析的结果一致。 4.以光学显微镜和扫描电镜观察虫草子实体可孕部分,发现KY虫草与蒙山九州虫草在子实体形态、子囊排列方式和包埋方式、子囊壳的形态等方面基本一致;通过rDNA的ITS区、18S及28S rDNA基因的序列比对,可以看出,两类虫草的碱基差异较小,其同源性高达99%,符合种内遗传特性。结合部分形态学指标和分子生物学数据两方面的特点,初步推断泰山采集的KY虫草与蒙山九州虫草可能为同物异名菌物。


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