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《曲阜师范大学》 2009年
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大仓鼠SSR座位的筛选及黑线仓鼠MHC基因的克隆与序列分析

解学辉  
【摘要】: 大仓鼠(Tscherskia triton)和黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)在我国分布范围广,繁殖力极强,是危害农业、传播疾病的有害动物,因此本论文主要针对这两类害鼠展开分子生物学方面的研究。 微卫星是一种较好的分子遗传标记,在种群进化研究、种群结构分析、遗传多样性等研究中得到了广泛的应用。大仓鼠(Tscherskia triton)是广泛分布于我国长江以北的重要害鼠之一。过去关于大仓鼠微卫星座位的筛选、利用其进行遗传多样性研究的报道较少。研究一使用经典的酚/氯仿抽提法从保存于-70℃的肝脏组织中提纯北京顺义、河北固安、饶阳等地区大仓鼠的基因组DNA,并利用大仓鼠近缘种—原仓鼠(Cricetus cricetus)、金仓鼠(Mesocricetus auratus)和黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)的10对微卫星引物(LOC-1至LOC-6;SSR1至ssrf11),通过PCR扩增筛选大仓鼠的微卫星座位,并对可能含有微卫星的阳性克隆进行测序,最终得到33个微卫星序列。利用BLAST序列分析软件对GenBank数据库进行检索,没有找到同源性一致的相应微卫星序列,表明33个大仓鼠微卫星序列都是首次发现的。注册序列的GenBank登陆号为EF690673~EF690693,EU140825~EU140836。这些微卫星序列可以分成三类:完美型占39.4%,非完美型占24.2%,复合型占36.4%。另外可见重复次数在8~20的微卫星序列最多,占60.6%,重复次数在21次以上的占39.4%。大部分微卫星序列的二核苷酸重复次数均在12以上,可以进行后续大仓鼠微卫星引物设计和相应的种群多态性分析。 主要组织相容性复合体(MHC)是由紧密连锁、高度多态的基因位点所组成的染色体上的一个区域,MHC基因具有高度多态性,对于维持种属的生存与延续具有重要的生物学意义。MHC的突出特性及其重要的功能使其在免疫遗传学、群体遗传学和抗病育种学等领域具有独特的效力。 研究二应用MHCⅠ类基因来探讨黑线仓鼠种群间的遗传结构,寻找分子遗传标记。根据已报道的四个黑线仓鼠MHCⅠ类基因序列以及人、大鼠和小鼠的相应序列,设计了一对特异性引物(SS1),从临沂沂南、潍坊临朐及曲阜吴村三个种群的黑线仓鼠基因组DNA中扩增了编码MHCⅠ类α2结构域的基因片段,并进行测序,得到的GenBank序列登录号为:FJ619112~FJ619183。结果表明:(1)黑线仓鼠MHCⅠ类α2结构域的序列多态性较为丰富,255 bp长度中有41个多态位点,多态位点百分率为16.08%;(2)群体间遗传多样性存在差异:多态位点百分率为吴村(14.51%)>临朐(13.73%)>沂南(12.55%);核苷酸多样性指数(Pi)为临朐(0.05278)>吴村(0.05097)>沂南(0.04884);平均核苷酸差异数目(K)值为临朐(13.458)>吴村(12.998)>沂南(12.454);单倍型多样性指数(Hd)都很高,说明编码MHCⅠ类分子α2结构域基因的核苷酸序列的变异较大;基于单个多态位点的群体动态的遗传参数(θ_ω)值则为吴村(0.03575)>临朐(0.03436)>沂南(0.03026);(3)三个地理种群的氨基酸序列中均存在与抗原多肽结合的位点,且极其保守,序列编码区的蛋白质预测图均包含α螺旋和β折叠,吴村种群α螺旋略有差异;(4)种群间的遗传分化指数接近,单倍型出现交叉,说明三个种群间的遗传分化不明显;(5)多态性丰富的编码MHCⅠ类分子α2结构域的基因序列,适宜作为黑线仓鼠不同群体的分子遗传标记。 研究三对MHCⅡ类DQA基因的外显子2进行克隆和序列分析。提取黑线仓鼠3个群体(吴村、沂南和临朐)的基因组DNA构建基因池,利用PCR扩增得到249 bp的目的片段,将该目的片段连接到pMD18-T载体中,重组质粒转入大肠杆菌DH5α后利用蓝白斑法筛选阳性克隆,测序后得到该目的片段的核苷酸序列(GenBank登录号:FJ209306)并推导出氨基酸序列。结果表明:黑线仓鼠、人、大鼠、小鼠、猪、马、牛、兔之间DQA基因外显子2的核苷酸序列同源性为68.7%~85%,氨基酸序列同源性为56.8%~83.5%,黑线仓鼠与大鼠、小鼠亲缘关系更近。测序得到的DQA基因外显子2序列具有丰富的种间多态性,可以作为物种遗传分析的分子标记。
【学位授予单位】:曲阜师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:Q78

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【引证文献】
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【参考文献】
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