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《郑州大学》 2010年
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HBV核心区启动子反义真核表达载体的构建

李华  
【摘要】: 背景 HBV感染是一个严重威胁到人类健康的全球性问题,HBV是引起急慢性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞肝癌的重要致病因素。抗病毒治疗是目前慢性乙型肝炎的关键性治疗措施,现有的抗病毒药物干扰素-α和核苷类似物的疗效有限,基因治疗日益成为目前的研究热点之一。基因治疗的关键在于选择良好的转基因载体、合适的目的基因和实现目的基因的可控性表达。基因工程中应用最多的载体是真核细胞表达载体,如病毒类载体,它们能将目的基因导入宿主细胞并稳定表达。本实验选择真核表达载体pEGFP-C1,为在细胞水平和体内观察其抑制HBV复制效果打下基础,同时选择HBV core启动子(core promoter, cp)作为目的基因(因为该启动子指导HBV pgRNA和pc mRNA转录的正确启动),构建HBV cp的反义真核表达载体,该载体可以转录出cp的反义RNA,反义RNA与pgRNA中的cp部分结合有可能使pg RNA逆转录为负链DNA受阻,同时可能导致pg RNA翻译蛋白的水平下降,从而使HBV合成和包装下降,最终有可能使HBV的复制长期受到抑制。 目的 HBV核心区启动子的克隆及其反义真核表达载体的构建,为乙型肝炎的基因治疗探索新的治疗靶点。 方法 1.提取HBV DNA:选取外周血HBV DNA载量大于106IU/ml的慢性乙型肝炎患者,用体液病毒提取试剂盒提取HBV DNA。 2.PCR扩增HBV核心区启动子序列:选取HBV全长序列中nt1636-nt1860作为扩增片段(该片段包含有HBV核心区启动子),用Taq DNA聚合酶进行PCR反应扩增HBV核心区启动子,琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物,初步确定引物及提取的HBV DNA模板的可实用性;用Pfu DNA聚合酶PCR扩增HBV核心区启动子序列,以增加扩增基因的保真性,扩增产物进行载体构建。 3.重组质粒pEGFP-C1-cp的构建及鉴定:将扩增的HBV核心区启动子和真核表达载体pEGFP-C1经限制性内切酶SacⅡ和HindⅢ分别酶切,用T4DNA Ligase连接后得到重组质粒pEGFP-C1-cp。将重组质粒pEGFP-C1-cp转化感受态大肠杆菌(escherichia coli, E.coli)DH5α,选取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定,鉴定后测序。 结果 1.HBV核心区启动子的PCR扩增:用Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶扩增后的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,在225bp处有特异性条带出现。 2.重组质粒pEGFP-C1-cp的鉴定:重组质粒pEGFP-C1-cp PCR反应后电泳,结果显示在225bp处有特异性条带出现;重组质粒pEGFP-C1-cp经SacⅡ和HindⅢ酶切后电泳,结果显示在约225bp和4700bp处均有特异性条带出现;重组质粒pEGFP-C1-cp中HBV核心区启动子测序结果与GeneBank公布的序列相一致,同源性为97%。 结论 本实验成功克隆了HBV核心区启动子序列,并构建了HBV核心区启动子的反义真核表达载体pEGFP-C1-cp。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R512.62

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【参考文献】
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