人源抗—抗GBM抗体单链抗体scFv3原核载体的构建、表达和纯化

【摘要】： 背景和目的 抗肾小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)疾病是一种罕见的自身免疫性疾病,特点是急进性肾小球肾炎和肺出血。虽然本病的发病率低,但多数患者病情重,预后差,死亡率高。介导本病的关键因素是抗GBM抗体。抗体与靶抗原结合后诱发免疫损伤,导致补体系统的活化,白细胞的侵润和蛋白尿的产生。因此,抗GBM抗体对于本病的发生发展有重要意义。 随着对肾小球基底膜病发病机制的深入研究,发现抗GBM抗体的主要靶抗原位于肾小球基底膜Ⅳ型胶原α3链的非胶原区1中[α3(Ⅳ)NC1]。在正常情况下,抗原表位(EA和EB)处于隐蔽位置。当感染、吸烟和接触有机溶剂时,抗原表位暴露,诱发自身免疫反应,产生抗GBM抗体。动物实验和临床观察已证明,抗肾小球基底膜抗体具有致病性。1967年,Lerner等人在Goodpasture综合征患者血清和肾脏中发现了抗GBM抗体,证明将此种抗体注入猴子体内可导致肾炎,从而证实了抗GBM抗体的存在及其致病作用,明确了Goodpasture综合征的发病与抗GBM抗体有关。近来研究发现抗GBM抗体的亚型、亲和力和滴度与病情的严重程度和预后有明显相关。正常人体内也能检测出抗GBM抗体,但其滴度和亲和力都显著低于患者且亚型不同,提示抗体的特性变化与发病有重要的关系。目前抗GBM病的主要治疗方法是强化血浆置换和免疫抑制联合。血浆置换的目的是清除循环中的抗GBM抗体,而免疫抑制剂使新的抗体形成减少。国外报道,早期应用强化血浆置换合并糖皮质激素和环磷酰胺治疗,85%的患者能够存活,40%进入终末期肾脏病ESRD(end-stage renal disease)。而早期未诊断治疗的患者死亡率可达89%。因此,积极清除和抑制抗体的产生是治疗和改善预后的关键。如果能获得针对抗GBM抗体的特异性抗体,使这种特异性抗体与抗GBM抗体结合,抑制和阻断抗GBM抗体与基底膜靶抗原的结合,那么就可以延缓和阻止疾病的发生。 目前,噬菌体展示技术已成为抗体工程的一项重要技术,它将大量的多肽和蛋白展示在噬菌体表面,建成噬菌体抗体库,通过亲和筛选直接从抗体库中筛选出特异性强、亲和力高的噬菌体抗体。由于噬菌体抗体容易经过改建在大肠杆菌或酵母菌中大规模生产。因此,噬菌体抗体表现出了巨大的潜能和广阔的应用前景。 本实验所用的单链抗体scFv3基因是在北京大学通过噬菌体展示技术筛选所得。我们通过基因工程重组技术和亲和层析技术,得到了纯化的单链抗体scFv3,经间接ELISA试验鉴定了这种单链抗体与抗GBM抗体的免疫反应性。为获得大量高纯度的单链抗体scFv3,以便进一步分析其特性和大规模生产,我们将抗体scFv3基因亚克隆入表达载体PET系统,在大肠杆菌中进行高效表达纯化。 材料与方法： 本实验以噬菌体展示技术所筛选的单链抗体scFv3基因为模板,XP1和XP2为引物,进行PCR扩增。将目的基因回收后克隆入pGEM-T Easy载体,转入大肠杆菌Top10,通过蓝白筛选,选出阳性克隆。经PCR和酶切鉴定证实克隆载体pGEM-scFv3构成。提取质粒DNA,用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,再将目的DNA片段亚克隆入原核表达载体pET28a(+),转入大肠杆菌BL21(DE3)。选出阳性克隆,进行酶切和测序鉴定。鉴定之后,将重组菌用IPTG30℃诱导表达20小时,SDS-PAGE电泳分析。通过HisLink Spin蛋白纯化系统,获得纯化的单链抗体scFv3。最后,纯化的抗体蛋白经间接ELISA法初步检测其免疫反应性。 结果 1、扩增的基因片段约750bp,与筛选所得的scFv3基因大小相符。 2、PCR和酶切鉴定证实scFv3基因已插入pGEM-T Easy载体,克隆载体pGEM-scFv3构建成功。 3、PCR和酶切证实scFv3基因已亚克隆入表达载体pET28a(+)，转入大肠杆菌BL21(DE3)。测序验证克隆入表达载体的基因序列与筛选所得的单链抗体scFv3基因序列相同。 4、SDS-PAGE电泳显示重组菌诱导表达出一条明显的蛋白条带,分子量在27kD左右。 5、通过亲和层析技术,获得了纯化的scFv3蛋白。 6、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)初步证实纯化的单链抗体scFv3与抗GBM抗体有免疫反应性。 结论 1、成功构建了克隆载体pGEM-scFv3。 2、成功构建了表达载体pET28a-scFv3。 3、单链抗体scFv3分子量为27kD,可通过亲和层析技术纯化。 4、纯化的单链抗体能与抗GBM抗体结合,具有较好的免疫反应性。