收藏本站
《郑州大学》 2010年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

杜氏盐藻RbcS基因家族新成员的克隆及功能研究

冯玖玲  
【摘要】: RbcS (the small subunits of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase)基因是编码1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)小亚基的基因。这种酶是叶绿体内含量最高的一种蛋白,位于叶绿体基质内,能催化光合作用中固定CO2的反应,其小亚基RbcS对全酶Rubisco的结构和功能起调控作用,且常以基因家族的形式定位于一条或多条染色体上,大多数高等植物中包含4~10个RbcS基因,各基因表达的氨基酸序列有差异,但是蛋白质在功能上基本是相似的。高等植物中的RbcS基因家族各成员在植物的各个器官及发育的各个时期的表达情况不完全一样,所受的调控机制也不同,这种表达调控上的不同在转录水平和转录后水平都存在,各个基因在DNA-蛋白质结合和mRNA稳定性方面都存在差异,也就是说以基因家族的形式存在不是单纯地为了增加基因产物的表达。 盐分是影响植物发育增殖的一个重要因素,高盐下,在多数植物以及蓝藻中,盐胁迫是抑制光合作用的,但盐藻却能增强光合作用,Liska等的研究表明当盐藻从低盐环境转移到高盐环境时,它能通过增强光合作用,增加C02的同化,从而产生大量甘油,达到适应高盐环境的目的。其中RbcS在C02的同化及淀粉合成方面发挥重要作用,但是盐藻的RbcS在盐分胁迫下的表达调控机制研究不多。本研究根据RbcS高度保守的氨基酸序列设计简并引物,采用RACE法扩增其5’和3’上下游未知序列,得到RbcS2新序列。再根据全长cDNA设计特异引物,利用荧光定量PCR方法分析光照和盐分对其表达的影响,这些为下一步研究RbcS基因家族中各成员的结构和功能,以及为探索盐胁迫下盐藻耐盐的分子机制提供实验依据。 实验方法 1简并引物扩增杜氏盐藻RbcS基因家族新成员的部分cDNA序列 根据GenBank上登录的杜氏盐藻、莱茵衣藻、红球藻、团藻等藻类的RbcS基因高度保守的氨基酸序列设计简并引物。采用TRIzol试剂提取杜氏盐藻细胞总RNA,用M-MuLV反转录酶合成cDNA第一链为模板,PCR扩增RbcS基因的部分cDNA片段,产物用T-A法亚克隆到pMD18-T载体上,酶切鉴定后测序,结果与GenBank上其他物种的RbcS基因比对分析。 2 RACE扩增杜氏盐藻RbcS2上下游序列 根据上述扩增出的RbcS2部分cDNA序列设计特异引物,以5’和3'RACE法扩增上下游未知序列,PCR产物用T-A法亚克隆到pMD18-T载体上,酶切鉴定后测序 3杜氏盐藻RbcS2全长cDNA的拼接和分析 将扩增出的简并cDNA,5’和3'RACE cDNA进行拼接,到cDNA全长序列,并利用DNAMEN和GenBank BLAST分析核苷酸和氨基酸的同源性及密码子偏好性。 4杜氏盐藻RbcS2功能分析 根据已克隆到的杜氏盐藻RbcS2的cDNA设计特异引物,以已知的杜氏盐藻保守基因GAPDH为内参照,Trizol试剂分别提取光照下和不同盐度下,不同时间培养的盐藻总RNA,反转录成cDNA,利用荧光定量PCR分析其光照和耐盐功能。 实验结果 1简并引物扩增杜氏盐藻RbcS基因家族新成员的部分cDNA序列 测序结果表明,简并引物扩增得到的部分cDNA片段长为209 bp,其氨基酸序列为69个氨基酸。BLAST结果表明,与GenBank中其他物种的RbcS有很高的同源性,且与杜氏盐藻RbcS1氨基酸的同源性为84%,说明所得的序列是杜氏盐藻RbcS的一个新片段。 2 RACE扩增杜氏盐藻RbcS2上下游序列 5'RACE得到一个有302个核苷酸的序列,除去部分已知序列及非编码区序列,共得到一个有168未知核苷酸的序列,由其推导的氨基酸序列有56个氨基酸残基,5'UTR部分有90个核苷酸。3'RACE得到一个有489个核苷酸的序列,除去部分已知序列及非编码区序列,共得到一个有271未知核苷酸的序列,由其推导的氨基酸序列有90个氨基酸残基,3'UTR部分有218个核苷酸。 3杜氏盐藻RbcS2全长cDNA的拼接和分析 将简并引物、5'RACE、3'RACE扩增得到的三段cDNA序列拼接起来,得到的cDNA全长为869 bp,包含561 bp的开放读码框,推导成多肽链包含187个氨基酸,BLAST结果显示,RbcS2的氨基酸序列与其他物种的RbcS的氨基酸序列有很高的同源性,且与杜氏盐藻的RbcS1(GenBank登录号AY739272)进行同源性分析,核苷酸和氨基酸序列的相似性分别为77.89%和77.19%,说明所得的序列是杜氏盐藻RbcS的一个新的片段,克隆得到了完整的杜氏盐藻RbcS基因家族的一个新成员RbcS2基因的cDNA序列,且与其它微藻的氨基酸序列同源性高些,与高等植物的氨基酸序列同源性低。对该基因密码子的使用偏好性进行分析,具有两种以上同义密码子的氨基酸偏好使用以C/G为结尾的密码子,表明杜氏盐藻和其他真核生物一样一般偏爱以C/G结尾的密码子。 4杜氏盐藻RbcS2功能分析 在黑暗条件下,RbcS2的表达量相对较低,RbcS2对光照的反应随时间推移,其转录表达先快速上升,达到平台期后逐步下降并趋于稳定,光照能强烈诱导该基因的表达,并具有时间效应。高盐下,RbcS2基因的转录表达高于正常水平,又由于有光照的影响,二者均随光暗有表达起伏变化。 结论与讨论 盐胁迫下,多数植物的光和作用都是受到抑制的,但盐藻却能增强光合作用。为分析盐藻高盐下促进光合作用独特的盐耐受性能,本研究从光合作用中固定CO2的关键基因RbcS入手,克隆到其基因家族中的一个新序列RbcS2的cDNA全长,并以此设计一对特异引物,利用相对荧光定量PCR分析其光照和耐盐功能。结果表明,与暗环境相比,光照能在一定时间内诱导RbcS2基因的转录表达;在高盐胁迫条件下,RbcS2的转录高于正常水平。高盐下,盐藻RbcS2的升高说明其可能是一个与盐胁迫相关的基因;这些结果为从分子水平上研究高盐下,盐藻的光合作用不是降低而是加强提供一些实验依据,及为高盐下盐藻分子水平的耐盐机制奠定基础。
【学位授予单位】:

知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前17条
1 柴玉荣,陈华艳,王天云,侯卫红,袁保梅,王建民,薛乐勋;杜氏盐藻RbcS基因cDNA片段的克隆和序列分析[J];郑州大学学报(医学版);2005年02期
2 杨晶;张亚敏;李曹龙;王爱英;祝建波;;新疆雪莲rbcs基因的克隆及序列分析[J];中国农学通报;2014年15期
3 王友如;;浮萍中一个新rbcS基因启动子的克隆及分析[J];分子植物育种;2010年01期
4 曹凯鸣,袁卫明,詹树萱,顾其敏,徐豹;野生大豆rbcS基因的克隆及结构分析[J];植物学报;1996年09期
5 周晓馥,麻鹏达,王仁厚,朱筱娟,刘宝,王兴智;转录后基因沉默系统研究烟草rbcS基因功能[J];遗传学报;2005年06期
6 董浩;赵轶君;李红民;;生菜rbcS基因启动子序列的克隆与分析[J];华北农学报;2013年01期
7 乔永旭;;黄瓜和黑籽南瓜幼苗RBCs对低温胁迫的应答差异[J];中国农业大学学报;2015年04期
8 陈伟珂;王亦虹;;基于RBCS模型的公共政策风险对策系统[J];中国软科学;2004年01期
9 卢碧霞;张改生;夏勉;马守才;;水稻rbcS启动子的克隆及其在转基因水稻中的特异性表达[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2007年01期
10 刘巧泉,于恒秀,张文娟,王红梅,顾铭洪;水稻rbcS启动子控制的外源基因在转基因水稻中的特异性表达[J];植物生理与分子生物学学报;2005年03期
11 孙雪;杨锐;刘必谦;裴鲁青;;坛紫菜rbcS及rbcL-rbcS基因间隔区的序列分析[J];水产科学;2006年01期
12 Eduward Laine ,Randolph Steadman ,黄海龙;肝移植术中用全血与RBCs和FFP的比较[J];国外医学.输血及血液学分册;2003年04期
13 向太和;水稻RuBPCase小亚基基因(rbcS)全长cDNA的克隆和分析[J];浙江大学学报(理学版);2005年03期
14 柴玉荣,王亚锋,王天云,侯卫红,王宁,王建民,薛乐勋;盐藻rbcS基因克隆及其原核表达(英文)[J];四川大学学报(自然科学版);2005年04期
15 刘翠敏,熊延,王淑芳,王宁宁,王勇;紫萍P143品系植物rbcS基因的cDNA克隆与表达[J];植物生理学通讯;2002年03期
16 刘德兵;魏军亚;李飞;贺军虎;魏守兴;谢子四;陈业渊;;香蕉rbcS基因启动子的克隆及序列分析[J];西北植物学报;2010年02期
17 毕学知,宋运淳,任南,刘立华,鄢慧民;水稻光敏素基因(phyA)和-1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基基因(rbcS)的染色体定位[J];植物生理学报;1999年01期
中国重要会议论文全文数据库 前5条
1 孙雪;马斌;周成旭;;蛋白核小球藻rbcS部分基因序列的克隆与分析[A];中国海洋湖沼学会藻类学分会第七届会员大会暨第十四次学术讨论会论文摘要集[C];2007年
2 周晓馥;王兴智;;利用转录后基因沉默系统研究烟草rbcS基因功能的模式的建立[A];中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
3 郑立敏;谢联辉;吴祖建;;苎麻花叶病毒NSP与本氏烟RBCS的互作研究[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
4 张素巧;周君莉;宋林霞;马力耕;朱玉贤;孙大业;;细胞外钙调素对光不依赖的rbcs基因表达的影响[A];全国植物分子生物学与生物技术学术研讨会论文集[C];2000年
5 张素巧;周君莉;宋林霞;马力耕;孙大业;;细胞外钙调素对光不依赖的rbcS基因表达的影响[A];西部大开发 科教先行与可持续发展——中国科协2000年学术年会文集[C];2000年
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 周晓馥;病毒载体诱导转录后基因沉默系统的建立及烟草(Nicotiana benthamiana)rbcS基因功能的研究[D];东北师范大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 冯玖玲;杜氏盐藻RbcS基因家族新成员的克隆及功能研究[D];郑州大学;2010年
2 李春燕;蛋白核小球藻rbcS基因的克隆及其启动子活性的分析[D];宁波大学;2010年
3 董浩;生菜离体再生体系的建立及其rbcS基因启动子的获得[D];西北大学;2013年
4 习雨琳;一些单、双子叶植物RBCS基因启动子的克隆及其表达特性分析[D];中国农业科学院;2012年
5 齐国昌;青稞耐盐性品种(系)的筛选及rbcS基因的克隆与表达分析[D];四川农业大学;2014年
6 张洪山;超冷RbCs极性分子的制备与光谱测量[D];山西大学;2012年
7 黄海群;水稻rbcs基因启动子的克隆、功能分析及应用[D];华中农业大学;2006年
8 韩琳;大豆rbcS基因启动子的遗传转化及功能分析[D];吉林农业大学;2013年
9 李峰;玉米BT2基因、RbcS基因克隆及等位杂合位点杂种优势分析[D];甘肃农业大学;2011年
10 常雪芳;超冷RbCs极性分子的光缔合制备及光谱测量[D];山西大学;2014年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978