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《郑州大学》 2010年
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LI患者TGM 1基因序列分析及其指甲中TGase 1活性与内皮蛋白表达相关性分析

王远志  
【摘要】: 人体表面的上皮细胞(Surface epithelial cells)如角质形成细胞(keratinocyte,KC)等,在经历了细胞分化演变后形成一个复层表皮结构。该复层表皮结构是机体抵御外界影响的十分坚固的物理、化学屏障。而实现该屏障功能最关键的结构成分是位于表皮最浅层的角质膜套(cornified cell envelope, CE)。角质膜套是一个坚固的蛋白质/类脂聚合体,形成于细胞膜下,而固定于已死亡的角质细胞(cornified cells)表面。它包含蛋白膜套(protein envelope)和脂质膜套(lipid envelope)两个部分。在角质形成细胞终末分化阶段,内皮蛋白(involucrin)、兜甲蛋白(loricrin)、富含脯氨酸小蛋白(small proline-rich protein)等结构蛋白的共价交联,对于角质膜套的形成具有十分重要的意义。这些交联反应需要转谷氨酰胺酶1 (transglutaminase 1, TGase 1)的参与。转谷氨酰胺酶1是一个钙离子依赖性酶,可以催化蛋白分子间异肽键的形成。 转谷氨酰胺酶1在角质形成细胞的终末分化阶段,开始表达并被激活,通过交联反应来促进角质膜套的生成。编码转谷氨酰胺酶1的基因(TGM 1)已经被学者从人类基因组DNA中分离出来,并进行了描述。其含有14.3千碱基对,包含了15个外显子。转谷氨酰胺酶1是参与角质膜套的合成而被人们所认识的。在角质形成细胞分化进程中,转谷氨酰胺酶1被蛋白水解酶有限裂解而激活,进而参与到随后的底物交联中去。因此,转谷氨酰胺酶1活性的紊乱可以产生异常的皮肤表型。 内皮蛋白是第一个被发现和克隆的前体物质,是角质膜套的一个重要的组成成分。其开始表达于角质形成细胞分化阶段早期,被认为是早期膜套的组成成分,为随后其它的前体物质的交联提供膜套支架。在体外,该交联优先选择Gln496位点。交联是一个有序的过程,Gln496是第一个交联位点,其他的交联位点随时间的往后推移而逐渐发挥作用。 板层状鱼鳞病(Lamellar ichthyosis, LI)是一种常染色体隐性遗传病,是一种严重的皮肤角化紊乱,表现为皮肤的泛发性过度角化。由于在表皮终末分化阶段,转谷氨酰胺酶1介导了细胞膜套交联的形成,所以TGM 1突变造成的转谷氨酰胺酶1的功能缺陷被普遍认为是板层状鱼鳞病的病因。此外,在板层状鱼鳞病患者的异常角质膜套中,人们观察到了过度表达的内皮蛋白。因此,转谷氨酰胺酶1的功能异常可以改变内皮蛋白的交联和角质膜套的形成。但是,转谷氨酰胺酶1的活性和内皮蛋白的表达两者之间的联系仍然不清楚,亦未见有相关报道。 本实验对板层状鱼鳞病患者TGM 1基因的突变,板层状鱼鳞病患者和对照组的转谷氨酰胺酶1的活性、内皮蛋白的表达以及转谷氨酰胺酶1的活性和内皮蛋白的表达两者之间的相关性进行了探讨。 1.收集8例板层状鱼鳞病患者(LI组)和8例志愿者(对照C组)指甲,并抽取2例板层状鱼鳞病血液标本。 2.将抽取的2例板层状鱼鳞病血液标本送本元正阳基因公司进行TGM1基因序列分析。 3.采用CellyticTM试剂提取指甲总蛋白。 4.样品蛋白进行SDS-PAGE电泳,对电泳条带进行转膜,再采用免疫印迹法检测内皮蛋白。(图像分析)。 5.采用斑点印迹法检测TGase 1酶活性。(图像分析)。 6.采用SPSS10.0统计分析软件进行两组间的方差分析和相关性分析。 1.患者TGM 1基因序列分析:2例LI患者TGM 1基因序列的第3、8、12及13外显子皆有错义的点突变,其中1例症状较重者还有第3外显子150T的缺失导致的提前终止。 2.两组指甲总蛋白SDS-PAGE电泳结果比较:LI组指甲总蛋白SDS-PAGE电泳显示5条主带,即69kDa、63kDa、54kDa、48kDa、38kDa,C组显示后4条主带。LI组69kDa、63kDa的灰度均值(GSM)分别为131.98±1.35、154.36±1.46,C组63kDa的GSM为136.56±1.38,两组63kDa的GSM相比,P0.05。 3.两组指甲内皮蛋白表达的GSM比较:LI组内皮蛋白表达于69kDa、63kDa主带,其GSM分别为139.92±1.44、148.54±1.6;C组内皮蛋白表达于63kDa主带,其GSM为135.96±1.10。两组63kDa内皮蛋白表达的GSM相比,P0.05。 4.两组指甲TGase 1酶活性的GSM比较:TGase 1的GSM为122.49±1.32,C组为169.11±1.14,C组TGase 1斑点印迹信号强于LI组,两组相比,P0.05。 5.内皮蛋白表达与TGase 1酶活性的相关性:C组63kDa内皮蛋白表达与TGase1酶的GSM呈正相关(r=0.762,P0.05),LI组63kDa、69kDa内皮蛋白与TGase 1酶的GSM呈负相关(r分别为-0.780、-0.837,P均0.05)。 1.两例板层状鱼鳞病患者的TGM 1基因序列分析,显示第8、12、及13外显子皆有错义的点突变,其中1例症状较重患者还有第3外显子150T的缺失导致的提前终止,提示LI组的TGase 1的表达存在异常。 2.LI组指甲总蛋白SDS-PAGE电泳显示5条主带,而C组显示4条主带,提示LI组的指甲总蛋白存在异常。 3.LI组内皮蛋白表达于69kDa、63kDa主带,C组内皮蛋白定位于63kDa主带,提示LI组内皮蛋白可能过度表达。 4.C组TGase 1斑点印迹信号强于LI组,提示LI组的TGase 1活性弱于对照组C组。 5.C组63kDa内皮蛋白表达与TGase 1酶活性的GSM呈正相关,LI组69kDa、63kDa内皮蛋白表达与TGase 1酶活性的GSM呈负相关,提示LI组内皮蛋白的过度表达可能是对TGase 1酶活性异常导致LI患者皮肤屏障功能缺陷的一种代偿性表达。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R758.52

【参考文献】
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