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《郑州大学》 2010年
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骨髓间充质干细胞和伞状支撑骨移植术治疗股骨头坏死的实验研究

曹亚伟  
【摘要】:目的 股骨头坏死(Osteonecrosis of the Femoral Head,ONFH)是由于多种病因破坏股骨头血供使骨的活性成分(包括骨细胞、骨髓造血细胞和脂肪细胞)死亡的一种病理过程。该病发病率高,若未经有效治疗,约80%的患者将在1~4年内发生股骨头塌陷,关节功能毁坏,最终不得不接受人工全髋关节置换。但由于该病多发于中青年,且多为双侧关节同时受累,中青年实行人工关节置换术后远期疗效尚不理想。所以股骨头坏死的治疗目标除了改善临床症状外,更重要的是防止股骨头塌陷,延缓病变发展,尽量保留患者自身的股骨头,推迟甚至避免人工关节置换术。保留股骨头的理想治疗方法是既能有效改善股骨头的血液供应,加强坏死骨的修复,又能恢复股骨头的生物力学性能,防止塌陷。目前临床上尚无达到上述要求的理想方法。本研究将骨髓间充质干细胞和伞状支撑骨植入山羊股骨头坏死模型,通过影像学、组织学和生物力学检查观察其修复过程,探索一种新的治疗股骨头坏死的方法。 本研究分为三个部分。 方法 第一部分:改良的液氮冷冻法建立山羊股骨头坏死模型。12只健康1周岁中国青山羊均采用改良的液氮冷冻法随机侧别建立单侧股骨头坏死模型,采取髋关节后侧入路,不脱位髋关节,不切开关节囊,自关节囊边缘向股骨头负重区方向钻孔,用棉签蘸取液氮涂抹于孔内冷冻。分别于造模术后2天、2周、4周、8周分批处死(每批3只)行放射学、组织学观察。 第二部分:山羊骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定。取健康1周岁中国青山羊,髂骨穿刺抽取髂骨骨髓,采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,结合贴壁筛选法进行培养。观察细胞形态及生长情况,测定细胞成活率及传代细胞贴壁率,对第2,4,6代细胞采用连续计数法绘制出生长曲线,计算细胞倍增时间,免疫细胞化学染色法鉴定细胞表面抗原标志。 第三部分:骨髓间充质干细胞和伞状支撑骨移植术治疗股骨头坏死的实验研究。44只健康1周岁中国青山羊全部用改良的液氮冷冻法随机侧别制作单侧股骨头坏死模型。造模8周后,随机挑选2只处死,行放射学、组织学检查检测造模情况。余42只随机分为A、B、C三组(每组14只),于模型侧分组施术。A组为骨髓间充质干细胞和伞状支撑骨移植术组。采取髋关节后侧入路进入,凿取带股方肌蒂骨柱,同时在取骨柱处凿取4~6根带皮质骨的小骨柱,清除股骨头内死骨后取已制备好的山羊自身的骨髓间充质干细胞悬液混合于小部分松质骨植于股骨头软骨下,并于股骨头内的前、后、内、外多方向植入4~6根小骨柱,中间植入带股方肌蒂骨柱(大骨柱),周围空腔用松质骨填充压实,使这些骨柱支撑类似撑开的伞状;B组为单纯股方肌骨柱移植术组;C组为骨髓间充质干细胞和松质骨移植术组。彻底清除坏死骨,在坏死侧股骨头内先植入其自身的骨髓间充质干细胞,但是不植骨柱,仅为打压植入松质骨。三组的健侧均作为自身正常对照。分别于术后3、6个月行放射学、组织学检查及生物力学测定。 结果 第一部分术后2天,股骨头出现骨细胞坏死,X线检查模型侧可见低密度针道影;术后2周可见骨髓纤维化,骨小梁周围骨髓基质细胞增多,X线显示针道影模糊,模型侧股骨头无明显骨坏死改变;4周时可见修复反应出现,X线显示股骨头负重区出现囊性变,周围骨质硬化;8周时模型侧股骨头骨小梁变细、稀疏、断裂、排列紊乱,骨细胞变性死亡,可见大量空骨陷窝,软骨表面毛糙,部分脱落,软骨下骨坏死区可见增生结缔组织,X线显示模型侧股骨头骨密度不均,负重区软骨面轻度塌陷。各组正常侧股骨头均无异常变化。 第二部分骨髓间充质干细胞原代细胞呈“满天星”样分布,圆形,大小均匀,周围有少量血细胞。培养24h后部分细胞贴壁,呈椭圆形。48 h后更多细胞贴壁,呈梭形、多角形。4-6d后形成细胞集落,随培养进行细胞集落逐渐增多,12~14d长满瓶底80%,即可行细胞传代。传代后4h细胞贴壁,1-6代细胞12h贴壁率大于90%,24h贴壁率可达100%。6~8d长满瓶底,细胞融合率可达100%,16代细胞成活率均大于95%。传代细胞呈均一长梭形,细胞膜及细胞核清晰,细胞密度较高时呈放射状、漩涡状排列。第2代骨髓间充质干细胞免疫组化染色,细胞表面抗原CD29, CD44呈阳性表达(胞浆呈黄褐色染色),CD34, CD45呈阴性表达。生长曲线呈S型,1~2d为潜伏期;2~3d后进入对数增长期;6~7d后进入平台期。第2,4,6代细胞倍增时间分别为25.61h,27.89h,28.66h,平均倍增时间为(27.38±2.03)h。 第三部分治疗术后3个月:(1)X线检查:A组、B组手术侧股骨头外形恢复,囊性低密度区消失,原塌陷已修复,股骨头无再塌陷。A组植骨愈合良好,骨柱影已模糊;B组植骨愈合欠佳,骨柱影仍较清晰;C组手术侧骨修复效果明显较A组、B组差,股骨头轮廓不规则,扁平塌陷,密度不均。(2)组织学观察:A组骨小梁成熟,排列规则;B组骨小梁幼稚,排列不规则;C组骨小梁变细、稀疏、断裂。①3组手术侧和正常侧股骨头骨小梁面积分数百分比分别为:(40.18±2.71和41.90±2.52)、(36.21±2.46和41.56±2.35)、(31.42±2.74和41.90±2.48)%。A组骨小梁面积分数百分比高于B组、C组(P0.05),与正常侧比较差异无统计学意义(p0.05)。②3组手术侧和正常侧空骨陷窝计数百分比分别为:(12.01±1.53和11.53±1.32)、(18.35±1.51和11.68±1.21)、(22.23±1.12和11.47±1.26)%。A组空骨陷窝计数百分比低于B组、C组(P0.05),与正常侧比较差异无统计学意义(p0.05)。(3)生物力学检测:3组手术侧和正常侧股骨头软骨下骨最大压缩强度和平均弹性模量分别为:(77.43±2.65和120.60±4.18)、(64.43±1.55和84.85±2.31)、(42.10±1.25和54.72±2.09)MPa,(82.61±2.02和127.37±4.74)、(83.09±1.23和126.36±1.39)、(83.91±1.32和126.85±2.88)MPa。33组手术侧和正常侧股骨头松质骨的最大压缩强度和平均弹性模量分别为:(46.63±1.32和81.74±3.96)、(39.48±0.75和63.78±1.27)、(30.83±0.73和45.90±2.34)MPa,(48.75±0.72和87.77±2.01)、(48.65±0.83和86.42±1.39)、(48.78±0.72和87.34±1.61)MPa。A组手术侧股骨头软骨下骨、松质骨的最大压缩强度和平均弹性模量高于B组、C组(p0.05),与正常侧比较差异无统计学意义(p0.05)。治疗术后6个月:X线检查A组、B组手术侧股骨头己为正常股骨头X线表现,而C组手术侧股骨头己完全塌陷。组织学检查A组、B组手术侧股骨头空骨陷窝计数百分比、骨小梁面积分数百分比与正常侧比较差异已无统计学意义(P0.05),且A、B组差异亦无统计学意义(P0.05)。生物力学测试显示A组、B组手术侧股骨头软骨下骨、松质骨的最大压缩强度和平均弹性模量与正常侧比较差异无统计学意义(p0.05),且A、B组差异亦无统计学意义(p0.05) 结论 第一部分采用改良的液氮冷冻法可以制作出股骨头坏死伴关节面轻度塌陷的动物模型。该造模方法动物死亡率低,坏死成功率高,操作简单,创伤较小,可重复性大,不破坏关节面及髋关节的稳定性,适合模拟临床上开窗减压植骨治疗股骨头坏死的实验研究。 第二部分应用密度梯度离心法结合贴壁培养法获得的山羊骨髓间充质干细胞纯度较高,生长状态良好。通过免疫细胞化学染色法鉴定细胞表面抗原标志,结合细胞生物学特性的观察,证实实验中所获取细胞是骨髓间充质干细胞。此方法简便可靠,可以为组织工程与细胞工程等学科提供优良的种子细胞。 第三部分骨髓间充质干细胞和伞状支撑骨移植术能有效恢复股骨头的生物力学性能,促进坏死区骨修复,防止股骨头塌陷。有望为临床上成人股骨头坏死的保头治疗提供一种新的途径。
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