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《郑州大学》 2010年
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食管鳞状细胞癌中Tom1L1对Src家族酪氨酸激酶Fyn负调控作用及其机制的研究

李鑫  
【摘要】:食管癌是全球第九大恶性疾病,其发病率在不同地区差异较大,我国是食管癌的高发地区,食管癌死亡率占我国恶性肿瘤死亡率的21.8%,其中河南省食管癌死亡占全省总癌死亡的40%左右,平均每年因食管癌死亡的病例约25000人。食管癌发生于食管粘膜上皮,在我国等食管癌的高发区,病理类型以鳞状上皮细胞癌为主,占95%左右,以食管鳞状细胞癌为研究对象具有明显的现实意义。虽然经过数十年的研究我们认为食管癌的发生与亚硝胺类化合物、微量元素的缺乏、吸烟、食管反流性疾病等因素有关,但其确切的发病机制仍然不清楚,这是造成目前其治疗效果不令人满意的主要因素。食管上皮组织从分化状态转变为增生状态的调控机制是我们解开食管上皮疾病的一把钥匙,尤其在食管癌的发生机制研究方面意义重大,相关研究为揭示食管癌发生机制提供了可能。 SRC家族酪氨酸激酶(SFKs)包括至少9种结构高度相似的非受体酪氨酸激酶,分别是Src、Fyn、Yes、Lck、Hck、Lyn、Blk、Yrk、Fgr。结构分析显示SFKs家族成员高度相似,结构中均包含保守结构单元。这些结构单元包括N端Src同源结构域4(SH4)、同源结构域3(SH3)、同源结构域2(SH2)、连接序列、激酶结构域和羧基端结构域。氨基端和SH4结构域含有豆蔻酰化位点而使激酶锚定于细胞膜。SH3结构域可以和富含脯氨酸序列的氨基酸结合,该结构域对激酶活性、胞内定位、募集作用和结合激酶底物起关键作用。SH2结构域的主要作用为结合磷酸酪氨酸结构单位。总之,SH3和SH2结构域在调控激酶催化活性上起关键作用。 SFKs在肿瘤方面的研究多集中于鸟类及哺乳动物成纤维细胞以及人类造血系统细胞方面。近来,有研究显示SFKs蛋白表达水平的异常升高与人类结肠癌、前列腺癌和非小细胞肺癌等多种上皮起源肿瘤的发生相关。然而,相关研究多集中于Src和肿瘤的关系方面,家族中其他成员涉及较少。最近的研究显示Fyn也是一个非常重要的有丝分裂信号分子和细胞周期调节因子,参与调控细胞生长、增殖、黏着等多种功能,在肿瘤的形成过程的信号转导通路方面扮演了重要的角色。理论上,激酶活性突变和负调控机制受损是肿瘤组织中SFKs水平增高的可能机制,然而SFKs活性突变在这些肿瘤中很少发生,故负调控机制受损可能是肿瘤组织中SFKs水平增高的主要机制,相关研究可能揭示他们的发病机制。 Src家族酪氨酸激酶Fyn在食管鳞状细胞癌的发生发展中扮演了何种角色?在食管鳞状细胞癌中其可能的负调控机制是什么?国内外研究均未见相关研究报道。本研究对此问题进行探究,试图发现其与食管鳞状细胞癌发生的关系并揭示其可能的负调控机制。 本论文的内容分为以下三部分: 第一部分实验材料和方法介绍 试剂配制方法参考《分子克隆实验指南》。涉及的主要实验方法包括:免疫组织化学方法、细胞免疫荧光方法、组织免疫荧光方法、免疫印迹方法、腺病毒载体的感染、细菌的转化、质粒DNA的抽提、质粒的转染、组织和细胞蛋白质的抽提等。 第二部分Src家族酪氨酸激酶Fyn和Tom1L1与食管鳞状细胞癌之间关系的研究 目的: 观察食管鳞状细胞癌中Src家族酪氨酸激酶Fyn和Tom1L1的表达,探索它们与食管鳞状细胞癌发生发展之间的关系。 方法: 1.免疫组织化学法观察Src家族酪氨酸激酶Fyn和Tom1L1在食管鳞状细胞癌组织中表达。 2.组织免疫荧光法观察Src家族酪氨酸激酶Fyn和Tom1L1在食管鳞状细胞癌组织中表达。 3.免疫印迹法观察Src家族酪氨酸激酶Fyn和Tom1L1在食管鳞状细胞癌组织中表达。 4.细胞免疫荧光法观察Src家族酪氨酸激酶Fyn和Tom1L1在人食管鳞状细胞癌TE1细胞株和食管上皮细胞EPC2-htert细胞株中的表达。 结果: 1.Src家族酪氨酸激酶Fyn在食管鳞状细胞癌组织中高表达,在正常食管粘膜组织中低表达。 2. Src家族酪氨酸激酶Fyn在人食管鳞状细胞癌TE1和TE9细胞株中高表达,在食管粘膜上皮细胞株EPC1-htert和EPC2-htert中低表达。 3. Src家族酪氨酸激酶Fyn在食管鳞状细胞癌组织中的表达高于正常食管粘膜组织,P0.01,差异有统计学意义。 4. Tom1L1在食管鳞状细胞癌组织中低表达,在正常食管粘膜组织中高表达。 5. Tom1L1在人食管鳞状细胞癌TEl和TE9细胞株中低表达,在食管粘膜上皮细胞株EPC1-htert和EPC2-htert中高表达。 6. Tom1L1在食管鳞状细胞癌组织中的表达低于正常食管粘膜组织,P0.05,差异有统计学意义。 结论: 1. Src家族酪氨酸激酶Fyn在食管鳞状细胞癌中高表达,在正常食管粘膜组织中低表达,提示其在食管鳞状细胞癌的发生发展过程中起重要作用。 2. Tom1L1在食管鳞状细胞癌中低表达,在正常食管粘膜组织中高表达,提示Tom1L1可能在食管鳞状细胞癌的发生发展过程中起负调控作用。 第三部分食管鳞状细胞癌中Tom1L1负调控Src家族酪氨酸激酶Fyn的作用及其机制的研究 目的: 探索食管鳞状细胞癌中Src家族酪氨酸激酶Fyn的负调控机制。 方法: 1.人pcDNA3.1- Tom1L1质粒DNA载体和人Tom1L1腺病毒载体(Ad- Tom1L1)转染和感染人食管鳞状细胞癌TE1细胞株,筛选较好的作用方法。 2.人pcDNA3.1- Tom1L1质粒DNA载体转染人食管鳞状细胞癌TE1细胞株,观察其对Src家族酪氨酸激酶Fyn的作用。 3. Tom1L1质粒DNA载体转染人食管鳞状细胞癌TE1细胞株,不同剂量多西环素作用后,观察之间的相互作用。 结果: 1.人pcDNA3.1- Tom1L1质粒DNA载体以脂质体法转染人食管鳞状细胞癌TE1细胞株后,免疫印迹检测Tom1L1的表达增高。 2.人Tom1L1腺病毒载体(Ad- Tom1L1)感染人食管鳞状细胞癌TE1细胞株后,免疫印迹检测Tom1L1的表达增高。 3. Quantity-one软件测量灰度,并经β-actin标准化后,pcDNA3.1-Tom1L1质粒DNA转染组的Tom1L1蛋白表达水平较Ad- Tom1L1腺病毒感染组高。 4.转染递加剂量的pcDNA3.1- Tom1L1质粒DNA, TE1细胞中Tom1L1蛋白的表达逐渐增高,而Fyn蛋白的表达逐渐减低。 5.转染相同剂量的pcDNA3.1- Tom1L1质粒DNA,不同剂量多西环素作用,显示随着多西环素剂量的递增,Fyn蛋白的表达明显降低。 结论: 1.人食管鳞状细胞癌TE1细胞株中pcDNA3.1-Tom1L1质粒DNA转染效率较人Tom1L1腺病毒载体(Ad-Tom1Ll)感染高。 2.人食管鳞状细胞癌TE1细胞株中Tom1L1对Fyn具有负调控作用。 3.多西环素对食管鳞状细胞癌TE1细胞株中Tom1L1负调控Fyn作用起协同作用。 全文结论: 1. Src家族酪氨酸激酶Fyn是食管鳞状细胞癌发生机制中的一个重要信号分子。 2.在食管鳞状细胞癌中Tom1L1对Src家族酪氨酸激酶Fyn具有负调控作用。 3.多西环素对食管鳞状细胞癌中Tom1L1负调控Fyn具有协同作用。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R735.1

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