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《郑州大学》 2010年
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RNA同时干扰四个不同基因对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的体内外实验研究

宋英  
【摘要】:鼻咽癌是我国华南地区一种常见的恶性肿瘤,且发病率高。目前鼻咽癌的治疗多采用放疗为主结合化疗免疫治疗及手术治疗、中医治疗等的综合疗法,但由于放疗后易发生局部复发和远处转移,以及鼻咽癌细胞对化疗药物不敏感和化疗药物的严重毒副作用,从而影响了预后,并限制了进一步提高患者生存率。因此,从基因治疗的角度,寻找毒性低、疗效好、特异性强的新的治疗技术具有重要的临床意义。 RNA干扰技术是当今研究鼻咽癌基因治疗领域的一个热点。它是一种转录后基因沉默现象,在以往的实验中,通过单基因RNA干扰能够抑制肿瘤细胞的生长增殖。然而无论在基础研究或临床实验中,单独干扰某个基因对研究肿瘤的防治方面存在有很大局限性。利用分子生物学技术,针对不同基因发展的基因治疗技术,通过改变或修饰相关基因及其表达产物的方式治疗恶性肿瘤己成为肿瘤生物治疗中最引人注目的研究领域,也可能是恶性肿瘤治疗的希望所在。目前国内外研究同时干扰多个基因的报道较少。尤其三个以上的基因同时干扰更为少见。联合沉默肿瘤细胞中多个癌基因,会成为研究肿瘤基因治疗的一个前沿问题。也是肿瘤基因治疗中一个新的研究方向。 由于肿瘤的发生发展是多基因突变多步骤多因素共同作用的结果,我们分析,如果同时阻断其中的几条通路,对肿瘤的治疗效果可能比只阻断一条要好,为进一步研究多基因共沉默在肿瘤治疗中的作用,我们带着这样一个全新观念需要验证的思路,通过不同检验手段付诸于实验来验证多个基因串联在一起的真核质粒能否同时沉默目的基因的表达并且能否能够最大限度地发挥基因沉默的效果。研究多基因共干扰的前提是设计出一种方法,能够同时转染干预多个基因的表达。 本实验通过利用分子生物学基因克隆技术,VEGF,C-myc,Survivin,hTERT的cDNA序列构建并鉴定一个载体同时编码VEGF,C-myc,Survivin,hTERT四个不同基因的shRNA质粒,与干扰单基因进行比较,将其导入CNE-2Z细胞,研究其能否对鼻咽癌细胞生长和增殖的抑制作用诱导细胞凋亡,能否最大限度地提高单个基因的沉默效率,为研究鼻咽癌基因治疗奠定实验基础并提供治疗策略,有望为鼻咽癌基因治疗提供一个行之有效的新思路。 方法 (1)构建同时表达VEGF,C-myc,Survivin,hTERT并含荧光素标记的shRNA质粒命名为P-1,并构建单独表达VEGF,C-myc,Survivin,hTERT的质粒,分别命名为P-2,P-3,P-4,P-5,分别将其将转染人鼻咽癌CNE-2Z细胞株。 (2)以激光共聚焦显微镜观察质粒在CNE-2Z细胞转染及表达情况。 (3)以噻哗蓝法检测细胞增殖活性。 (4) real-time-PCR在mRNA水平上检测对目的基因表达的抑制作用。 (5)免疫印迹法在蛋白水平上检测对目的基因的封闭效果。 (6) Transwell侵袭小室模型观察导入CNE-2Z细胞对其恶性生物学行为的改变。 (7)流式细胞仪观察各组凋亡率。 (8)体内裸鼠成瘤:以激光共聚焦显微镜观察质粒在移植瘤癌组织中转染及表达情况并通过体积变化,RT-PCR和免疫印迹及TUNNEL凋亡检测等指标观察质粒对肿瘤的抑制效果。 结果 (1)载体构建与鉴定质粒载体pGenesil 1.1,pGenesil 1.2,pGenesil 1.3, pGenesil1.4里面来只有一个Sad的酶切位点,而质粒VEGF,C-cmy, Survivin, hTERT均能够被SacI所酶切出一条约900bp,600bp,900bp,600bp不等的DNA条带,说明目的基因片段VEGF, C-myc, Survivin, hTERT已经分别插入到质粒载体pGenesil 1.1,pGenesil 1.2, pGenesil 1.3, pGenesil 1.4里。挑取克隆正确的质粒转化菌液VEGF, C-myc, Survivin, hTERT去测序。经测序结果分析:均为插入正确的克隆质粒,而且质量均符合设计标准。通过本实验,应用有效的克隆技术,构建出一个载体同时编码4个不同基因的表达质粒,这将为以后多基因共沉默奠定坚实的研究基础。 (2)质粒转染检测质粒转染细胞24h,空白对照组未见表达的绿色荧光细胞。其他各组均可见大量表达绿色荧光的细胞,其中阴性对照组细胞生长良好,有许多贴壁细胞表达绿色荧光。多基因组和各单基因组出现大量悬浮的表达绿色荧光的圆形死亡细胞。其中多基因组凋亡细胞数较多。我们将质粒转染CNE-2Z细胞后共聚焦显微镜下观察到大量表达绿色荧光的细胞,说明质粒能有效转染该细胞。 (3)MTT法检测细胞活力与空白对照组比较,P-1、P-2、P-3、P-4、P-5各组各时间点的细胞吸光度A值均显著下降,P0.05;p-1组分别和P-2、P-3、P-4、P-5各组之间比较,p-1组各时间点的吸光度A值差异有统计学意义P0.05。BC和NC组各时间点的吸光度A值差异没有统计学意义P0.05。p-1和P-2、P-3、P-4、P-5转染癌细胞96小时细胞生长抑制率分别达到72%、42%、41%、40%、45%。MTT结果显示转染细胞后,多基因组细胞增殖明显受抑制,说明同时沉默VEGF, C-myc, Survivin,hTERT四个基因比单独沉默其中的一个基因能更有效的抑制CNE-2Z细胞的生长。 (4)转染后48小时不同基因在不同组别中的mRNA定量表达.在p-1和p-2中VEGF的抑制率分别是:76.47%±2.08和69.75%±3.05在p-1和p-3中C-myc的抑制率分别是:79.73%±3.01和77.43%±1.98在p-1和p-4中Survivin的抑制率分别是:80.89%±2.35和73.92%±2.56在p-1和p-5中hTERT的抑制率分别是:74.60%±2.68和70.47%±2.87。实时定量PCR结果显示各个单基因质粒转染CNE-2Z细胞后引起单个基因的mRNA表达下降,多基因质粒转染CNE-2Z细胞后引起四个基因的mRNA同时表达下降,说明多基因组的mRNA沉默作用强于单基因。 (5)转染48小时后western blotting蛋白检测。VEGF基因在P-1、P-2中的蛋白抑制率分别是66.95%±2.42和64.30%±3.13,C-myc基因在P-1、P-3中的蛋白抑制率分别是62.89%±2.97和59.18%±3.09Survivin基因在P-1、P-4中的蛋白抑制率分别是79.48%±1.92和70.51%±2.56hTERT基因在P-1、P-5中的蛋白抑制率分别是79.60%±1.87和76.33%±4.11。蛋白印记结果显示各个单基因质粒转染CNE-2Z细胞后引起单个基因的蛋白表达下降,多基因质粒转染CNE-2Z细胞后引起四个基因的蛋白同时表达下降,说明多基因组的蛋白沉默作用强于单基因。 (6) Trans well侵袭小室模型测定细胞体外侵袭能力。7组细胞在48h后Trans well侵袭小室中多基因组穿膜细胞数比空白对照组和单基因组明显减少(P0.05)单基因组和空白对照组穿袭细胞数也存在统计学差异(P0.05),而阴性对照组与空白对照组比较无统计学差异(P0.05),表明单基因质粒和多基因组质粒均可转染可降低CNE-2Z细胞的体外侵袭能力,其中多基因组比单基因组更能明显地降低鼻咽癌细胞穿袭能力。侵袭实验结果显示转染细胞后,体外侵袭能力明显降低,说明同时沉默VEGF,C-myc,Survivin,hTERT四个基因比单独沉默其中的一个基因能更有效地降低恶性侵袭力。 (7)流式细胞仪检测细胞凋亡。处理48小时后,空白对照组凋亡率是5.3%±1.26,阴性对照组凋亡率是7.4%±1.02,p-1组凋亡率是37.6%±0.94,p-2组凋亡率是20.6%±1.27,p-3组凋亡率是22.6%±±0.98,p-4组凋亡率是23.7%±1.09,p-5组凋亡率是22.9%±1.31,空白对照组和阴性对照组凋亡率比较二者之间没有统计学差异(p0.05)。单基因组与空白对照组凋亡率比较二者之间有明显统计学差异(p0.05)。多基因组与空白对照组凋亡率比较二者之间有明显统计学差异(p0.01)。单基因和多基因组凋亡率比较二者之间具有明显统计学差异(p0.05)。流式细胞仪检测细胞凋亡实验表明同时沉默肿瘤细胞中多个基因比单独沉默一个基因能够更好的诱导肿瘤细胞凋亡。 (8)癌裸鼠动物模型的治疗效果。空白对照组和阴性对照组裸鼠肿瘤持续增长,体积明显增大;多基因治疗组和单基因治疗组肿瘤生长缓慢,其中多基因治疗肿瘤生长速度最慢.荧光显微镜下观察质粒治疗组和阴性对照组可见大片癌组织表达绿色荧光,而空白对照组的移植瘤未见绿色荧光。在治疗结束时,P-1,P-2、P-3、P-4、P-5组肿瘤比空白对照组肿瘤生长明显受到抑制。各组抑瘤率分别是,P-1:82.40%、P-2:46.24%、P-3:48.47%、P-4:51.93%、P-5:46.78%TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡率:空白对照组和阴性对照组偶可见凋亡细胞,凋亡指数为分别为2.8±01.12、3.7±0.95; VEGF、C-myc、Survivin和hTERT单基因质粒组凋亡细胞凋亡指数分别为21.5%±2.31、23.8%±1.98、19.9%±2.75和24.60%±±3.09。多基因质粒组凋亡细胞明显增多凋亡指数为49.8%±1.98。表明单基因组和多基因组对鼻咽癌移植瘤均有诱导凋亡作用,其中多基因组诱导凋亡作用最明显。 结论 本实验首次通过多基因干扰证实了不同基因的沉默导致相应mRNA及目的蛋白的表达下调,从而有效抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡,移植瘤生长明显受到抑制,初步证实RNA同时干扰四个不同基因比单独抑制其中的一个基因能够更好的抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞的增殖,促进细胞的凋亡。本研究为鼻咽癌的基因治疗提供了一个新的研究方向。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R739.63

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