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CsA对大鼠脑缺血再灌注损伤OX-42、iNOS表达的影响及对髓鞘的保护作用研究

杜家琇  
【摘要】:背景和目的 脑缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)是脑缺血在恢复血液再灌注后,缺血细胞损伤程度进一步加重的病理现象,其病理机制复杂,包括自由基损伤、细胞内Ca2+超载、炎性细胞因子的浸润、凋亡基因的激活、兴奋性氨基酸的神经毒性作用等多种因素,近年来,免疫炎症因素在缺血再灌注损伤中扮演的角色越来越受到人们的重视。 小胶质细胞(microglia,MG)作为神经-免疫-内分泌系统的核心,和多种神经系统疾病病理过程有关,资料表明,抑制小胶质细胞的过度活化,减少相关炎性介质的表达,可以减轻脑缺血再灌注损伤,有明显的脑保护作用,而诱导型一氧化氮合酶(iNOS)细胞定位在MG,和MG的活化相关,是MG影响脑缺血再灌注损伤的关键因素。MG生成iNOS后释放大量的一氧化氮(NO),是引起髓鞘破坏的毒性物质之一,因此,通过对小胶质细胞的干预,减少iNOS的表达在一定程度上可能有髓鞘保护作用。目前在急性脑缺血再灌注损伤方面的研究较少。 环孢素A(cyclosporin A,CsA)是一种有效的免疫抑制剂,主要用于对抗肝肾移植后的排斥反应。然而越来越多的试验表明CsA有脑保护作用,其脑保护机制和抑制钙调神经磷酸酶(CaN)活性、封闭线粒体通透性转换孔(MPTP)、降低小胶质细胞活性及其相关炎性介质有关,目前CsA对小胶质细胞的影响方面的研究较少,在脑缺血再灌注损伤后对髓鞘的影响也不清楚。 本研究通过采用改良线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,用CsA作为干预药物治疗,采用免疫组化SP染色技术,动态观察脑缺血再灌注后大鼠海马CA1区OX-42、iNOS以及胼胝体区髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达情况,变色酸2R-亮绿SF双重染色法髓鞘染色,观察急性脑缺血再灌注损伤后髓鞘的变化,及CsA的干预作用,并对大鼠神经行为学进行评分,为探索脑缺血的神经保护剂的应用,提供理论依据和新的思路。 材料与方法 1.实验动物分组及给药方法 成年健康Sprague-Dawley(SD)大鼠72只,随机分为3组,假手术组、模型组和环孢素A组,每组24只,每组分为4个亚组。环孢素A组手术后每天腹腔注射环孢素A (20mg/kg),模型组和假手术组每日腹腔注射等体积的生理盐水 2模型制作和入选标准 采用改良线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。模型组和环孢素A组缺血2小时进行再灌注,假手术组仅分离颈总动脉。动物麻醉苏醒后,参照Zea-longa等评分标准,1-3分为入选对象。 3脑组织切片的制备 大鼠心脏灌注后断头取脑后,常规固定、脱水、石蜡包埋。制成4μm和6μm的切片,分别用于免疫组化染色和变色酸2R-亮绿SF双重染色法髓鞘染色。 4检测指标 (1)参照Zea-longa等评分标准,对大鼠神经行为学进行评分; (2)髓鞘染色,光学显微镜下观察髓鞘变化; (3)采用SP法进行免疫组化染色,观察大鼠海马CA1区OX-42、iNOS以及胼胝体区MBP的表达。 5图像分析 每个标本随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400),测定每个视野下的阳性区平均灰度值,以5个视野的平均灰度值的平均值作为该例的测量值。应用图象分析系统进行检测。 6统计学方法 采用SPSS12.0统计软件处理,实验数据用均数±标准差(x±S)表示,采用单因素方差分析,组间比较采用LSD检验,α=0.05为显著性检验性水准。 结果 1实验动物一般情况及神经行为学评分 假手术组:无神经系统功能缺陷,动作敏捷,反应灵敏,自由食水;模型组:精神萎靡,食欲不振,自主活动少,不同程度出现左侧霍纳氏征,追尾征以及强迫姿势;环孢素A组较模型组情况改善,且神经行为学评分优于模型组,差异有统计学意义。 2变色酸2R-亮绿SF双重染色法髓鞘染色 结果显示,假手术组髓鞘染色的切面红绿相间,类似鱼骨刺状,排列紧密,髓鞘为红色,轴索呈绿色。模型组1d、3d与假手术组相比无明显差异,7d、14d胼胝体髓鞘染色疏松、空泡形成,髓鞘密度明显降低。环孢素A组7d、14d胼胝体髓鞘密度较假手术组也明显降低,但好于模型组。 3海马CA1区OX-42的免疫组化染色 假手术组可见少许OX-42阳性表达的小胶质细胞,模型组、环孢素A组1d即有OX-42的大量表达,3d时OX-42达到高峰,14d时接近正常,环孢素A组1d、3d、7d较模型组有显著性差异(P<0.05)。 4海马CA1区iNOS的免疫组化染色 假手术组海马CA1区可见少量iNOS阳性表达,模型组1d时iNOS表达最高,3d时下降但仍高于正常,7d时接近正常,环孢素组较模型组1d、3d表达减少,经统计学处理有显著性差异(p<0.05)。 5胼胝体区MBP的免疫组化染色 与假手术组相比,模型组、环孢素A组胼胝体MBP阳性纤维1d即有减少,3d明显减少,7d有所恢复,14d仍低于正常,环孢素A组好于模型组,经检验有显著性差异(P<0.05)。 结论 1.小胶质细胞及诱导型一氧化氮的过度活化和脑缺血再灌注损伤明确相关; 2.免疫抑制剂环孢素环孢素A可显著减少脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞的激活和iNOS的表达,有白质保护作用。


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