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《郑州大学》 2011年
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位点特异性重组系统在甘蓝型油菜中的建立

王绍辉  
【摘要】:位点特异性重组技术是通过特异性重组酶对DNA特定序列进行准确切割和重新连接,从而在基因或染色体水平上对生物进行遗传改造的一种技术。位点特异性重组系统在转基因植物基因的定点整合、基因删除、多基因植物表达载体建立、多基因叠加、遗传育种等方面都有十分重要的意义。 本实验选用Cre/loxP和FLP/FRT两个位点特异性重组系统,以GFP(绿色荧光蛋白)为报告基因成功构建了两个表达载体Z1与Cer40,用于在甘蓝型油菜中建立Cre/loxP及FLP/FRT两个位点特异性重组系统。在转基因成苗实验过程中,采用农杆菌浸染法转化植株,摸索了卡纳霉素抗性筛选的最佳浓度,以下胚轴和子叶柄为外植体的再生体系经过共培培养、延迟培养、筛选培养及生根培养等植物组织培养过程成功转化了12棵Z1载体阳性苗和3棵Cer40载体阳性苗。 本实验还就实验过程中由于一些染菌和移栽失败,造成一些阳性苗濒临灭绝的问题摸索了一整套以叶片为外植体再生成苗的体系。并应用在了稀缺苗上,成功得到了大量再生苗,解决了此项问题。 后期成苗检测研究过程中,用普通PCR方法在油菜基因组中检测到卡纳抗性基因,初步判断为转基因植株。通过以CRE酶基因为探针进行PCR-southern bolt杂交分析,分析结果显示有明显的预期信号出现,进一步表明表达载体已经整合到油菜染色体中。通过半定量法在RNA水平上检测到了Cre基因的表达,并得出了每个植株表达量的差异。这不仅证实了位点特异性重组系统成功的在甘蓝型油菜中表达,同时也为以后研究工作提供了有力依据。 本实验成功在甘蓝型油菜中建立了Cre/loxP与FLP/FRT位点特异性重组系统,并进一步检测了阳性苗的表达情况,为在甘蓝型油菜中实现基因定点整合和多基因叠加等研究目标迈出了重要的一步。研究结果为后期实验提供了有力依据。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S565.4

【参考文献】
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