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《郑州大学》 2011年
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铁代谢在肺癌中的异常改变及对构建异种移植瘤的影响

程哲  
【摘要】:肺癌是一种发病率、死亡率很高的恶性肿瘤,尤其是近50年来,在欧美等发达国家和我国的某些工业城市,肺癌发病率已跃居各种恶性肿瘤之首,且呈现年轻化、女性化的趋势。在美国及全球范围内,肺癌已居癌症死亡原因的首位。肺癌全称为支气管肺癌,是起源于支气管粘膜上皮的恶性肿瘤,在肺癌的病理类型中非小细胞肺癌占了绝大多数,高达85%,小细胞肺癌占15%。非小细胞肺癌可分为三个主要组织学亚型:鳞状细胞癌、腺癌、大细胞肺癌。在肺癌的病因研究中,目前普遍公认吸烟是导致大多数的肺癌发生的原因之一,但是仍有25%的肺癌不可归因于吸烟,并且每年死亡的人数超过30万。虽然非小细胞肺癌的早期诊断标准和治疗策略在不断改进,但是其早期诊断的手段仍然不足,预后也较差。目前肺癌的治疗仍以手术、化疗、放疗为主,但是占肺癌大多数的非小细胞肺癌对化疗不敏感,5年生存率仍然较低,因此,进一步寻找非小细胞肺癌早期诊断手段、治疗策略和预防方法已成为国内外研究的热点。 铁是人体必需的微量元素之一,对细胞的正常生长及维持细胞正常功能有决定性作用。作为一种过渡元素,铁是合成DNA限速酶核酸核苷酸还原酶的辅基,参与DNA合成、电子传递等重要的生命代谢过程。哺乳动物中血红蛋白介导的氧气的运输、多种酶的活性包括过氧化氢酶,都涉及铁的参与,并起重要作用。铁能减少线粒体产生ATP时产生的氧,在能量通路中扮演重要角色。同时,铁在免疫系统及维持正常的免疫功能中起重要作用。另外,因为铁具有减少氧的能力,铁是大多数生化体系中自由基的主要诱导剂。已发现多种疾病存在铁代谢异常,如肝炎、糖尿病、帕金森综合征、子宫内膜异位症等。 恶性肿瘤的发生是细胞恶性增殖、凋亡不足的结果,所有涉及细胞代谢、增殖、凋亡的多种因素都可能与恶性肿瘤的发生、发展以及侵袭转移有关。目前认为铁含量升高是肿瘤发生的危险因素,铁和肿瘤具有相关性。已发现多种癌症患者体内存在铁代谢异常,参与铁代谢的各种标志物水平发生改变:(1)铁蛋白(Ferritin, Fn),尤其血清Fn水平,在多种肿瘤中明显增加,研究发现在神经母细胞瘤中,血清Fn起到自分泌生长因子的作用,并且和肿瘤分期具有相关性,具有提示患者预后的作用;(2)转铁蛋白(transferrin, Tf),在体内将铁从外周血转运至细胞内,可作为细胞的生长因子,无论是体内细胞还是体外细胞,某些肿瘤组织自身可合成转铁蛋白,促进细胞增殖和分化;(3)转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR),目前发现有两种:TfR1和TfR2。相关研究表明,TfR1在多种肿瘤中表达明显增多,如脑肿瘤,TfR1单克隆抗体可抑制体外肿瘤细胞的生长;(4)铁调节蛋白(Iron regulatory Protein,IRP),通过在转录后水平调节铁蛋白及转铁蛋白的表达来调控细胞的体代谢。IRP分为IRP1和IRP2,体外实验表明IRP1与IRP2能识别并结合各自特异的靶RNA序列,而且IRP2对IRE结构的自然变异比IRP1敏感。一些培养细胞(如鼠J774巨噬细胞)的铁代谢调节中,IRP2起主导作用,甚至部分只表达IRP2,提示IRP2可作为细胞内铁平衡的唯一调节剂。 已有铁与肿瘤关系的研究,但关于肺癌方面的研究较少,且多是检测血清铁代谢相关蛋白的含量、或者是铁相关基因产物在组织中的表达,发现铁代谢相关基因产物在肺癌组织或者患者血清中表达与正常对照或者与良性疾病有差异,但差异的发生原因以及铁代谢在肺癌发生中的作用机制未见报道。本研究拟从分子,细胞,组织到动物四个层次进行研究,以进一步探讨其机制:(1)从基因水平和蛋白水平检测肺腺癌患者的癌组织及正常肺组织标本铁代谢标志物Fn、Tf、TfR、IRP2的表达;(2)采用反义寡核苷酸转染技术使A549细胞IRP2基因沉默,观察对铁代谢其他标志物的影响;(3)体外培养A549细胞,通过不同浓度的铁剂(三氯化铁,FeCl3)和铁螯合剂(去铁胺,DFO),观察对细胞的增殖、凋亡的影响,同时探讨相应状态下铁代谢标志物的基因和蛋白表达情况;(4)在此基础上,用不同浓度的铁剂和铁螯合剂作用后的A549细胞,构建裸鼠移植瘤模型,研究铁在动物体内对肿瘤的影响,进一步探讨铁与肺癌发生的关系。 本实验从分子水平、基因水平、蛋白水平、细胞水平、组织水平、体内试验等多个研究层面,采用免疫组织化学、Western blot、PCR、RT-PCR、MTT法、Tunel法、流式细胞术、琼脂糖凝胶电泳、反义寡核苷酸技术、构建异种移植瘤等,研究了铁代谢在肺癌中的异常改变及机制以及对构建裸鼠异种抑制瘤的影响,以期为肺腺癌的分子靶向治疗提供理论依据。 第一部分铁代谢相关基因及蛋白在肺腺癌组织中的表达 目的 研究肺癌组织中铁代谢相关基因及表达产物是否存在异常,探讨铁代谢在肺癌发生中的机制。 方法 1.采用免疫组织化学方法(SP法)检测肺癌和正常肺组织中铁代谢相关基因Tf、TfR、Fn、IRP2的蛋白表达产物。 2.采用RT-PCR方法检测肺癌和正常肺组织中铁代谢相关指标Tf、TfR、Fn、IRP2的基因表达。 结果 1.Tf在肺腺癌组织中阳性表达率为73.33%,在正常肺组织中阳性表达率为23.33%,二者之间的差异具有统计学意义(χ2=15.02,P0.05);TfR在肺腺癌组织中阳性表达率分别为63.33%,在正常肺组织中阳性表达率为13.33%,二者之间的差异具有统计学意义(χ2=15.86,P0.05);Fn在肺腺癌组织中的阳性表达率为16.66%,在正常肺组织中阳性表达率为70.00%,二者之间的差异具有统计学意义(χ2=17.38,P0.05);IRP2在肺腺癌组织中阳性表达率为70.00%,在正常肺组织中阳性表达率为26.66%,二者之间的差异具有统计学意义(χ2=11.28,P0.05)。 2. Tf mRNA在肺腺癌组织相对含量为0.291±0.066,正常肺组织相对含量为0.175±0.004,二组间比较,差异具有统计学意义(t=--5.400,P0.05);TfR mRNA在肺腺癌组织相对含量为0.441±0.031,正常肺组织相对含量为0.249±0.030,二组间比较,差异具有统计学意义(t=-13.198,P0.05);肺癌中Fn mRNA相对含量为0.289±±0.021,正常肺组织相对含量为0.970±±0.063,二组间比较,差异具有统计学意义(t=30.862,P0.05);在肺腺癌组织IRP2 mRNA相对含量为0.275±±0.022,正常肺组织相对含量为0.132±0.011,二组间比较,差异具有统计学意义(t=-14.992,P0.05) 小结 Fn在肺癌中的表达降低,而Tf、TfR、IRP2表达升高,提示肺癌在发生发展过程中对铁的需求增加,铁利用的增加需要Tf-TfR的转运,IRP2在其中起到调控作用。 第二部分铁代谢在肺腺癌发生中的分子机制 目的 研究IRP2基因沉默后对铁代谢相关基因及其产物表达的影响,探讨肺腺癌A549细胞的铁代谢调节机制。 方法 1细胞培养: 肺腺癌A549细胞用10%胎牛血清的1640培养液置于37℃,5%CO2培养,定期换液、传代。 2 IRP2 ASODN转染肺腺癌A549细胞 将肺腺癌A549细胞分为三组:对照组(含脂质体20μl/ml); ASODN组;SCODN组。 3采用RT-PCR检测转染前后Tf、TfR、Fn等铁代谢相关基因mRNA表达。 4采用Western blot检测IRP2及Tf、TfR、Fn等铁调节相关基因蛋白表达。 结果 1 ASODN转染后形态的改变 ASODN转染组细胞形态不规则,细胞核固缩,核碎裂,染色质片断化,分裂相少见,凋亡小体形成等。而对照组及SCODN组细胞形态基本正常,贴壁生长良好。 2转染前后Tf、TfR及Fn mRNA表达的改变 ①TfmRNA:对照组、SCODN组和ASODN组分别为:0.440±0.049、0.418±0.040、0.468±0.052,三组之间表达差异无统计学意义(F=2.18,P0.05); ②TfR mRNA:对照组、SCODN组和ASODN组分别为:0.504±0.052、0.456±0.096、0.323±0.032,三组之间表达差异有统计学意义(F=20.354,P0.05);三组之间两两比较,ASODN组与对照组和SCODN组相比,ASODN组TfR基因表达显著降低,差异具有统计学意义(P0.05),对照组与SCODN组间无显著性差异(P0.05); ③Fn mRNA:对照组、SCODN组和ASODN组分别为:0.360±0.048、0.391±0.032、0.555±0.065,三组之间表达差异有统计学意义(F=20.354,P0.05);三组之间两两比较,ASODN组与对照组和SCODN组相比,Fn mRNA表达高于对照组和SCODN组,差异具有统计学意义(P0.05),对照组与SCODN组间无显著性差异(P0.05)。 3转染前后Tf、TfR、Fn、IRP2蛋白表达 ①Tf蛋白表达:对照组、SCODN组和ASODN组Tf蛋白表达分别为:0.651±0.052、0.630±0.060、0.593±0.057,三组之间表达差异无统计学意义(F=2.668,P0.05); ②TfR蛋白表达:对照组、SCODN组和ASODN组TfR蛋白表达分别为:0.791±0.117、0.856±0.075、0.586±0.061,三组之间表达差异具有统计学意义(F=25.671,P0.05);三组之间两两比较,ASODN组TfR蛋白表达与对照组和SCODN组比较,差异均具有统计学意义(P0.05);对照组与SCODN组间无显著性差异(P0.05); ③Fn蛋白表达:对照组、SCODN组和ASODN组Fn蛋白表达分别为:0.485±0.038、0.483±0.038、0.693±0.077,三组之间表达差异具有统计学意义(F=49.748,P0.05);三组之间两两比较,ASODN组Fn蛋白表达与对照组和SCODN组之间差异均具有统计学意义(P0.05);对照组与SCODN组间无显著性差异(P0.05)。 ④IRP2蛋白表达:对照组、SCODN组和ASODN组IRP2蛋白表达分别为:0.617±0.100、0.553±0.094、0.120±0.024,三组之间表达差异具有统计学意义(F=113.224,P0.05);ASODN组IRP2蛋白表达与对照组和SCODN组比较,差异均具有统计学意义(P0.05),对照组与SCODN组间无显著性差异(P0.05)。 小结: 1 IRP2 ASODN转染后的A549细胞,IRP2蛋白表达显著降低; 2 IRP2 ASODN转染A549细胞后TfR mRNA及蛋白表达降低,Fn mRNA及蛋白表达增加,TfinRNA及蛋白表达无变化; 3在肺癌细胞中,IRP2可能通过蛋白量的改变来调节TfR和Fn的表达,进而调节铁代谢。 第三部分不同铁状态对肺癌细胞的增殖凋亡及铁代谢标志物的影响 目的 研究加铁、去铁处理对A549细胞增殖、凋亡以及铁代谢相关基因及其表达产物的影响,从细胞水平探讨铁代谢对肺癌发生的作用及机制。 方法 1.实验分组:①空白对照组;②50μmol/L三氯化铁(FeCl3)组;③100μmol/L三氯化铁(FeCl3)组;④50μmol/L去铁胺(DFO)组;⑤100μmol/L去铁胺(DFO)组。 2.MTT法检测A549细胞体外增殖能力。 3.Tunel流式细胞术及琼脂糖凝胶电泳观察A549细胞凋亡情况。 4.RT-PCR检测各组细胞铁代谢相关指标Tf、TfR、Fn、IRP2的mRNA水平。 5.Western blot检测各组细胞铁代谢相关指标Tf、TfR、Fn、IRP2的蛋白表达。 结果 1 FeCl3和DFO对A549细胞增殖的影响 1.1 FeCI3对A549细胞体外增殖的影响 FeCl3-50及FeCl3-100处理A549细胞12h后增殖抑制率分别为-0.242±0.034、-0.328±±0.039,差异具有统计学意义(t=5.256,P0.05);24h后增殖抑制率分别为-0.698±±0.066、-0.943±±0.071,差异具有统计学意义(t=7.997,P0.05);48h后增殖抑制率分别为-0.743±±0.071、-1.010±0.094,差异具有统计学意义(t=7.167,P0.05)。 按时间梯度比较,FeCl3-50及FeCl3-100处理A549细胞12h、24h、48h后,增殖抑制率随时间延长而变小(F=218.402,P0.05),两两比较,12h与24h和48h比较,差异有统计学意义(P0.05),处理48h后增殖抑制率与24h差异无统计学意义(P0.05)。 1.2 DFO对A549细胞体外增殖的影响 DFO-50及DFO-100处理A549细胞12h后增殖抑制率分别为0.461±0.032、0.608±±0.03,差异具有统计学意义(t=10.59800,P0.05);24h后增殖抑制率分别为0.819±±0.016、0.866±±0.011,差异具有统计学意义(t=7.56100,P0.05);48h后增殖抑制率分别为0.833±0.017、0.8844±0.021,差异具有统计学意义(t=5.969,P0.05)。 用重复测量方差分析对时间梯度进行比较,DFO-50处理A549细胞12h、24h、48h后,增殖抑制率随时间延长而增高(F=850.04,P0.05),两两比较,12h与24h和48h比较,差异有统计学意义(P0.05),处理48h后增殖抑制率与24h差异无统计学意义(P0.05);DFO-100处理A549细胞12h、24h、48h后,增殖抑制率随时间延长而增高(F=489.27,P0.05),两两比较,12h与24h和48h比较,差异有统计学意义(P0.05),处理48h后增殖抑制率与24h差异无统计学意义(P0.05)。 2 RT-PCR检测FeCl3、DFO处理A549细胞后Tf、TfR、Fn、IRP2的mRNA水平 2.1 FeCl3对A549细胞Tf mRNA水平的影响 FeCl3处理A549细胞12hTfmRNA水平:对照组、FeCl3-50组、FeCl3-100组分别为0.423±0.043、0.396±±0.027、0.3444±0.02,三组之间差异具有统计学意义(F=16.413,P0.05)。 FeCl3处理A549细胞24hTfmRNA水平:对照组、FeCl3-50组、FeCl3-100组分别为0.435±0.039、0.333±0.044、0.265±0.023,三组之间差异具有统计学意义(F=55.099,P0.05)。 用重复测量方差分析对时间梯度进行比较,FeCl3-50组在12h、24hTfmRNA水平随时间延长而降低,差异具有统计学意义(P0.05);FeCl3-100组在12h、24hTfmRNA水平随时间延长而降低,差异具有统计学意义(P0.05)。 2.2 FeCl3对A549细胞TfR mRNA水平的影响 FeCl3处理A549细胞12h TfR mRNA水平:对照组、FeCl3-50组、FeCl3-100组分别为0.479±0.045、0.469±0.039、0.385-0.032,三组之间差异具有统计学意义(F--17.576,P0.05)。 FeCl3处理A549细胞24hTfR mRNA水平:对照组、FeCl3-50组、FeCl3-100组分别为0.464±0.045、0.360±0.031、0.321±0.010,三组之间差异具有统计学意义(F=52.702,,P0.05)。 按时间梯度分析,FeCl3-50组在12h、24hTfRmRNA水平随时间延长而降低,差异具有统计学意义(t=6.919,P0.05);FeCl3-100组在12h、24hTfR mRNA水平随时间延长而降低,差异具有统计学意义(t=6.036,P0.05)。 2.3 FeCI3对A549细胞FnmRNA水平的影响 FeCl3处理A549细胞12h后Fn mRNA水平:对照组、FeCl3-50组、FeCl3-100组分别为0.380±0.032、0.460±0.046、0.599±0.047,三组之间差异具有统计学意义(F=69.437,P0.05)。 FeCl3处理A549细胞24h Fn mRNA水平:对照组、FeCl3-50组、FeCl3-100组分别为0.379±0.019、0.501±0.050、0.851±0.054,三组之间差异具有统计学意义(F=316.410,P0.05)。 按时间梯度分析,FeCl3-50组在12h、24hFn mRNA水平随时间延长而增加,差异无统计学意义(t=-1.908,P0.072);FeCl3-100组在12h、24hFn mRNA水平随时间延长而增加,差异具有统计学意义(t=11.132,P0.05)。 2.4 FeCl3对A549细胞IRP2 mRNA水平的影响 FeCl3处理A549细胞12h IRP2 mRNA水平:对照组、FeCl3-50组、FeCl3-100组分别为0.304±0.021、0.287±0.020、0.205±0.020,三组之间差异具有统计学意义(F=68.144,P0.05)。 FeCl3处理A549细胞24h IRP2 mRNA水平:对照组、FeCl3-50组、FeCl3-100组分别为0.311±0.022、0.256±0.022、0.206±0.011,三组之间差异具有统计学意义(F=76.749,P0.05)。 按时间梯度分析,FeCl3-50组在12h、24h IRP2 mRNA水平随时间延长而降低,差异具有统计学意义(t=3.297,F0.05);FeCl3-100组在12h、24h IRP2 mRNA水平差异无统计学意义(t=0.139,P0.05)。 2.5 DFO对A549细胞Tf mRNA水平的影响 DFO处理A549细胞12hTf mRNA水平:对照组、DFO-50组、DFO-100组分别为0.423±0.043、0.483±0.042、0.535±0.029,三组之间差异具有统计学意义(F=21.134,P0.05)。 DFO处理A549细胞24hTf mRNA水平:对照组、DFO-50组、DFO-100组分别为0.435±0.039、0.516±0.058、0.555±0.062,三组之间差异具有统计学意义(F=12.987,P0.05)。 按时间梯度分析,DFO-50组在12h、24hTf mRNA水平随时间延长而增加,差异无统计学意义(t=-1.457,P0.05);DFO-100组在12h、24hTf mRNA水平随时间延长而增加,差异无统计学意义(t=0.924,P0.05)。 2.6 DFO对A549细胞TfR mRNA水平的影响 DFO处理A549细胞12hTfRmRNA水平:对照组、DFO-50组、DFO-100组分别为0.479±0.045、0.484-0.043、0.597±0.067,三组之间差异具有统计学意义(F=15.888,P0.05)。 DFO处理A549细胞24hTfRmRNA水平:对照组、DFO-50组、DFO-100组分别为0.464±0.045、0.521±0.039、0.652±0.049,三组之间差异具有统计学意义(F=46.822,P0.05)。 按时间梯度分析,DFO-50组在12h、24hTfR mRNA水平随时间延长而增加,差异无统计学意义(t=2.016,P0.05);DFO-100组在12h、24hTfRmRNA水平随时间延长而增加,差异无统计学意义(t=2.095,P0.05)。 2.7 DFO对A549细胞Fn mRNA水平的影响 DFO处理A549细胞12hFn mRNA水平:对照组、DFO-50组、DFO-100组分别为0.380±0.032、0.292±0.015、0.230±0.021,三组之间差异具有统计学意义(F=98.313,P0.05)。 DFO处理A549细胞24hFnmRNA水平:对照组、DFO-50组、DFO-100组分别为0.379±0.019、0.215±0.024、0.196±0.019,三组之间差异具有统计学意义(F=235.643,P0.05)。 按时间梯度分析,DFO-50组在12h、24hFn mRNA水平随时间延长而降低,差异具有统计学意义(t=8.604,P0.05);FDFO-100组在12h、24hFn mRNA水平随时间延长而降低,差异具有统计学意义(t=3.797,P0.05)。 2.8 DFO对A549细胞IRP2 mRNA水平的影响 DFO处理A549细胞12h IRP2 mRNA水平:对照组、DFO-50组、DFO-100组分别为0.304±0.021、0.412±0.024、0.445±0.063,三组之间差异具有统计学意义(F=33.015,P0.05)。 DFO处理A549细胞24h IRP2 mRNA水平:对照组、DFO-50组、DFO-100组分别为0.311±0.022、0.401±0.019、0.541±0.051,三组之间差异具有统计学意义(F=117.266,P0.05)。 按时间梯度分析,DFO-50组在24hIRP2 mRNA水平差异无统计学意义(t=0.136,P=0.271);DFO-100组在24hIRP2 mRNA水平随时间延长而增加,差异具有统计学意义(t=3.745,P0.05)。 3 Western blot检测FeCl3、DFO干预后A549细胞Tf、TfR、Fn、IRP2蛋白水平 3.1 FeCl3对A549细胞Tf蛋白水平的影响 FeCl3处理A549细胞12hTf蛋白水平:对照组、FeCl3-50组、FeCl3-100组分别为0.640±0.023、0.607±0.030、0.574±0.035,三组之间差异具有统计学意义(F=11.462,P0.05)。 FeCl3处理A549细胞24hTf蛋白水平:对照组、FeCl3-50组、FeCl3-100组分别为0.626±0.044、0.567±0.036、0.512±0.032,三组之间差异具有统计学意义(F=22.810,P0.05)。 按时间梯度分析,FeCl3-50组在12h、24h Tf蛋白水平随时间延长而降低,差异具有统计学意义(t=2.699,P0.05);FeCl3-100组在12h、24hTf蛋白水平随时间延长而降低,差异具有统计学意义(t=4.134,P0.05)。 3.2 FeCl3对A549细胞TfR蛋白水平的影响 FeCl3处理A549细胞12hTfR蛋白水平:对照组、FeCl3-50组、FeCl3-100组分别为0.762±0.033、组0.643±0.022、0.426±0.034,三组之间TfR蛋白水平存在显著性差异(F=316.051,P0.05)。 FeCl3处理A549细胞24hTfR蛋白水平:对照组、FeCl3-50组、FeCl3-100组分别为0.793±0.051、0.570±0.034、0.341±0.025,三组之间TfR蛋白水平存在显著性差异(F=352.725,P0.05)。 按时间梯度分析,FeCl3-50组在12h、24h TfR蛋白水平随时间延长而降低,差异具有统计学意义(t=5.700,P0.05);FeCl3-100组在12h、24hTfR蛋白水平随时间延长而降低,差异具有统计学意义(t=6.369,P0.05)。 3.3 FeCl3对A549细胞Fn蛋白水平的影响 FeCl3处理A549细胞12hFn蛋白水平:对照组、FeCl3-50组、FeCl3-100组分别为0.497±0.038、0.507±0.020、0.550±0.050,三组之间差异具有统计学意义(F=5.528,P0.05)。 FeCl3处理A549细胞24hFn蛋白水平:对照组、FeCl3-50组、FeCl3-100组分别为0.471+0.029、0.647±0.051、0.902±0.09,三组之间差异具有统计学意义(F=121.661,P0.05)。 按时间梯度分析,FeCl3-50组在12h、24h Fn蛋白水平随时间延长而增加,差异具有统计学意义(-8.082,P0.05);FeCl3-100组在12h、24hFn蛋白水平差异具有统计学意义(t=10.812,P0.05)。 3.4 FeCl3对A549细胞IRP2蛋白水平的影响 FeCl3处理A549细胞12h IRP2蛋白水平:对照组、FeCl3-50组、FeCl3-100组分别为0.589±0.033、0.313±0.021、0.303±0.025,三组之间差异具有统计学意义(F=364.328,P0.05)。 FeCl3处理A549细胞24h IRP2蛋白水平:对照组0.589±0.024、FeCl3-50组0.277±0.032、FeCl3-100组0.299±0.220,三组之间差异具有统计学意义(F=18.185,P0.05)。 按时间梯度分析,FeCl3-50组在12h、24h IRP2蛋白水平随时间延长而降低,差异具有统计学意义(t=2.974,P0.05);FeCl3-100组在12h、24hIRP2蛋白水平随时间延长而降低,差异无统计学意义(t=-0.380,P0.05)。 3.5 DFO对A549细胞Tf蛋白水平的影响 DFO处理A549细胞12hTf蛋白水平:对照组、DFO-50组、DFO-100组分别为0.574±0.035、0.826±0.121、0.822±0.081,三组之间Tf蛋白水平存在显著性差异(F=27.946,P0.05)。 DFO处理A549细胞24hTf蛋白水平:对照组、DFO-50组、DFO-100组分别为0.626±0.044、0.734±0.058、0.796±0.063,三组之间Tf蛋白水平存在显著性差异(F=23.917,P0.05)。 按时间梯度分析,DFO-50组在12h、24h Tf蛋白水平随时间延长而降低,差异具有统计学意义(t=2.168,P0.05);DFO-100组在12h、24hTf蛋白水平随时间延长而降低,差异无统计学意义(t=0.801,P0.05)。 3.6 DFO对A549细胞TfR蛋白水平的影响 DFO处理A549细胞12hTfR蛋白水平:对照组、DFO-50组、DFO-100组分别为0.762±0.033、0.724±0.077、0.945±0.079,三组之间差异具有统计学意义(F=31.480,P0.05)。 DFO处理A549细胞24hTfR蛋白水平:对照组、DFO-50组、DFO-100组分别为0.793±0.051、0.803±0.069、0.938±0.077,三组之间差异具有统计学意义(F=55.869,P0.05)。 按时间梯度分析,DFO-50组在12h、24h TfR蛋白水平随时间延长而增加,差异具有统计学意义(t=3.089,P0.05);DFO-100组在12h、24hTfR蛋白水平差异无统计学意义(t=0.201,P0.05)。 3.7 DFO对A549细胞Fn蛋白水平的影响 DFO处理A549细胞12hFn蛋白水平:对照组、DFO-50组、DFO-100组分别为0.497±0.038、0.380±0.039、0.319±0.036,三组之间差异具有统计学意义(F=57.663,P0.05)。 DFO处理A549细胞24h Fn蛋白水平:对照组、DFO-50组、DFO-100组分别为0.471±0.029、0.343±0.020、0.168±0.017,三组之间差异具有统计学意义(F=456.794,P0.05)。 按时间梯度分析,DFO-50组在12h、24hFn蛋白水平随时间延长而降低,差异有统计学意义(t=2.670,P0.05);DFO-100组在12h、24hFn蛋白水平随时间延长而降低,差异具有统计学意义(t=11.994,P0.05)。 3.8 DFO对A549细胞IRP2蛋白水平的影响 DFO处理A549细胞12h IRP2蛋白水平:对照组、DFO-50组、DFO-100组分别为0.589±0.033、0.659±0.047、0.927±0.068,三组之间差异具有统计学意义(F=119.463,P0.05)。 DFO处理A549细胞24h IRP2蛋白水平:对照组0.589±0.024、DFO-50组0.725±0.049、DFO-100组0.954±0.075,三组之间差异具有统计学意义(F=118.096,P0.05)。 按时间梯度分析,DFO-50组在12h、24h IRP2蛋白水平随时间延长而增加,差异具有统计学意义(t=3.074,P0.05);DFO-100组在12h、24hIRP2蛋白水平随时间延长而增加,差异无统计学意义(t=0.843,P0.05)。 4FeCl3、DFO对A549细胞凋亡的影响 4.1 A549细胞凋亡形态学观察 不同浓度FeCl3和DFO处理A549细胞后,HE染色可见典型的凋亡细胞的形态学特征:细胞皱缩,折光性减弱,细胞内颗粒增多;DFO处理的A549细胞凋亡细胞明显多于FeCl3。 4.2 Tunnel法检测细胞凋亡 DFO促进A549细胞凋亡,随时间延长、浓度增加作用增强;而FeCl3却抑制细胞凋亡。 4.3 DNA琼脂糖凝胶电泳结果 不同浓度DFO处理A549细胞后的凋亡条带(ladder shape)随着浓度、时间延长明显增宽增多,而空白对照组无DNA梯形凋亡条带出现。不同浓度FeCl3处理A549细胞24h后几乎无凋亡条带(ladder shape)出现。 4.4流式细胞术检测结果 Annexin V/PI法检测细胞凋亡:在培养12h,对照组、DFO-50及DFO-100组早期细胞凋亡率(%)分别为1.40±0.01、3.02±0.05、10.32+0.51,三组比较差异具有统计学意义(F=2578.62,P0.05),两两比较,DFO-50及DFO-100组均较空白对照组升高,差异具有统计学意义(P0.05);在培养24h,对照组、DFO-50及DFO-100组早期细胞凋亡率分别为2.61±0.31、4.07±0.85、13.91±1.37,三组比较差异具有统计学意义(F=420.42,P0.05),两两比较,DFO-50及DFO-100组均较空白对照组升高,差异具有统计学意义(P0.05)。 在培养12h,对照组、FeCl3-50及FeCl3-100组早期细胞凋亡率分别为1.40±0.01、2.21±0.37、1.05±1.22,三组比较差异具有统计学意义(F=6.53,P0.05);两两比较,FeCl3-50及FeCl3-100组均较空白组降低,差异具有统计学意义(P0.05);在培养24h,对照组、FeCl3-50及FeCl3-100组早期细胞凋亡率分别为2.61±0.31、1.32±1.21、0.56±1.02,三组比较差异具有统计学意义(F=5.43,P0.05);两两比较,FeCl3-50及FeCl3-100组均较空白组降低,差异具有统计学意义(P0.05)。 小结 1.FeCl3处理A549细胞后,细胞增殖抑制率降低,细胞凋亡减少,提示FeCl3具有促进A549细胞生长的作用; 2.DFO处理A549细胞后,细胞增殖抑制率增加,凋亡细胞增多,提示DFO对A549细胞生长具有抑制作用; 3.FeCl3通过升高Fn mRNA和蛋白表达、降低Tf、IRP2、TfR mRNA和蛋白表达而促进A549细胞生长; 4.DFO通过降低Fn mRNA和蛋白表达、升高Tf、RP2、TfR mRNA和蛋白表达而促进A549细胞生长。 第四部分铁对构建人肺腺癌裸鼠异种移植瘤的影响 目的 构建加铁去铁处理后的A549细胞裸鼠移植瘤模型,研究不同铁状态的A549细胞成瘤能力,探讨体内铁负荷对肺癌发生发展的影响。 研究方法 1.裸鼠50只,随机分成5组:空白对照组、FeCl3-50、FeCl3-100、DFO-50和DFO-100组。 2.生理盐水及不同浓度的FeCl3、DFO处理后的A549细胞接种至裸鼠背部皮肤,皮下注射法构建肺腺癌裸鼠移植瘤模型。 3.观察裸鼠生存状态、成瘤时间、移植瘤平均体积及平均瘤重、根据瘤体体积绘制成瘤曲线。 结果 1.空白对照组、FeCl3-50组、FeCl3-100组平均成瘤时间(天)分别为6.267±0.191,4.133±0.099,3.056±0.109,三组比较差异具有统计学意义(F=5136.630,P0.05)。FeCl3-100组、FeCl3-50组平均成瘤时间均短于对照组,差异均具有统计学意义(P0.05);FeCl3-100组平均成瘤时间短于FeCl3-50组,差异具有统计学意义(P0.05)。空白对照组、DFO-50组、DFO-100组平均成瘤时间(天)分别为6.267±0.191、7.196±0.175、9.058±0.179,三组比较差异具有统计学意义(F=611.200,P0.05);DFO-100组、DFO-50组平均成瘤时间均长于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);DFO-100组平均成瘤时间长于DFO-50组,差异具有统计学意义(P0.05) 2.FeCl3组裸鼠移植瘤平均体积在观察期内随时间延长而增大,同一时间点FeCl3-100组平均体积大于FeCl3-50组及空白对照组,FeCl3-50组平均体积大于空白对照组,各时间点三组比较差异均具有统计学意义(P0.05)。 3.DFO组裸鼠移植瘤平均体积在观察期内随时间延长而增大,在第3、6、9天DFO-100、DFO-50及空白对照组平均体积比较差异无统计学意义,在第12、15、18、21天DFO-100组平均体积小于DFO-50组及空白对照组,DFO-50组平均体积小于空白对照组,各时间点三组比较差异均具有统计学意义(P0.05)。 4.对照组、FeCl3-50组、FeCl3-100组平均瘤重(g)分别为0.535±0.097、0.666±0.069、0.690±0.204,三组比较差异具有统计学意义(F=3.73,P0.05);FeCl3-100组、FeCl3-50组平均瘤重均大于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);FeCl3-100组平均瘤重大于FeCl3-50组,但差异无统计学意义(PQ.05)。 5.对照组、DFO-50组、DFO-100组平均瘤重(g)分别为0.535±0.097、0.484±0.185、0.378±0.096,三组比较差异具有统计学意义(F=3.639,P0.05);DFO-100组平均瘤重小于DFO-50组和对照组,差异具有统计学意义(P0.05);DFO-50组平均瘤重小于对照组,但差异无统计学意义(P0.05)。 小结 成功构建裸鼠肺腺癌A549细胞移植瘤模型。用铁干预后的肺癌A549细胞接种裸鼠,发现加铁干预的A549细胞接种后的裸鼠,成瘤时间缩短,肿瘤平均体积和平均瘤重大于无干预组,肿瘤生长速度加快;DFO干预的A549细胞接种后的裸鼠,成瘤时间延长,肿瘤平均体积和平均瘤重小于无干预组,肿瘤生长速度减慢,表明铁参与肺癌的发生,促进裸鼠成瘤,铁螯合剂对动物成瘤具有抑制作用。 全文小结 1肺癌在发生发展过程中可能存在对铁的需求增加,导致Fn降低,而对铁起转运作用的Tf-TfR的表达增加,IRP2在其中起到调控作用。 2在肺癌细胞中,IRP2可能通过蛋白量的改变来调节TfR和Fn的表达,调控肺癌细胞的生长。为筛选肺癌治疗的靶基因提供理论依据。 3 FeCl3促进肺癌细胞A549增殖、抑制凋亡,同时,Fn表达升高,下调Tf、IRP2、TfR表达;铁螯合剂DFO则促进凋亡、抑制其生长,引起Fn表达下降,上调Tf、IRP2、TfR表达。这一发现不但解释了肺癌患者多数在诊断时已处于贫血状态的原因,同时也为如何处理患者的贫血状态提供依据,再者对高铁环境作业的防护具有重要指导价值。 4铁增强A549细胞株在裸鼠体内的致瘤性,而铁螯合剂能减弱A549细胞在裸鼠体内的致瘤性。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R734.2

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