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《郑州大学》 2011年
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APP695-siRNA慢病毒载体构建及其对SH-SY5Y细胞中APP695基因表达的作用

温丽君  
【摘要】:目的:构建针对APP695的siRNA慢病毒载体,并检测其对人神经纤维母细胞瘤细胞株SH-SY5Y中APP695基因表达作用的研究,可能为阿尔茨海默病的基因治疗提供新的途径。 方法:设计并合成针对筛选确定的APP695基因寡核苷酸序列特异性siRNA有效靶序列;同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列。合成后经退火形成双链DNA。将pFU-GW-iRNA质粒经HpaⅠ、XhoⅠ双酶切后,将退火形成的双链DNA连接到线性化pFU-GW-iRNA质粒,构建重组APP695-siRNA表达质粒。将重组质粒转化后挑取阳性克隆经PCR和测序鉴定。同时完成阴性对照重组质粒的构建。将它们分别和包装质粒混合物共转染包装细胞293T,产生具有感染能力的慢病毒颗粒,并进行滴度测定。然后感染SH-SY5Y细胞,分未经病毒感染(CON)组、阴性对照病毒感染(NC)组和慢病毒介导阳性干扰(APP695-RNAi)组;感染72h应用实时定量荧光PCR(FQ-RT PCR)检测各组细胞APP695 mRNA的表达水平。 结果:①阳性克隆的重组质粒经PCR鉴定和DNA测序证实目的寡核苷酸片段已被准确克隆到pFU-GW-iRNA质粒上。②各质粒与包装质粒共转染包装细胞293T后收获慢病毒颗粒。③各组慢病毒载体感染SH-SY5Y细胞72h后,APP695-siRNA组APP695 mRNA较CON组、NC组明显降低,差异有统计学意义(P0.001),而CON组与NC组间无明显差异(p=0.112)。 结论:针对APP695基因的siRNA被正确地克隆到pFU-GW-iRNA质粒上,并成功构建了针对APP695基因的siRNA慢病毒载体;该载体可有效沉默SH-SY5Y细胞中APP695 mRNA的表达。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R346

【参考文献】
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