氯化锂促人骨肉瘤细胞U2-OS凋亡及其机制的研究

【摘要】：背景和目的 骨肉瘤是一种起源于间叶组织的恶性肿瘤,好发于儿童和青少年的股骨远端、胫骨近端,易转移至肺、脑等组织,愈后较差,致残致死率高。70年代之前其治疗方法主要是手术截肢,5年生存率不足20%,目前通过手术结合新辅助化疗的方法,使其5年生存率提高到70%左右。但常用化疗药物如顺铂(PDD)、环磷酰胺(HDMTX)等长期应用副作用较大。研究表明,骨肉瘤的发生机制与原癌基因激活和抑癌基因失活等基因改变有密切关系。锂(lithium)是一种人体非必需微量元素,具有免疫调节等作用,有关研究已证实,其在体内外还具有广谱的抗肿瘤作用。在体外细胞实验中,其化合物氯化锂(LiCL)可抑制白血病K526、宫颈癌HL-60等多种瘤细胞的增殖并诱导凋亡。目前LiCL对人骨肉瘤U2-OS细胞系作用的研究尚未见文献报道。本实验拟通过观察LiCL在体外对U2-OS细胞增殖和凋亡的影响,探讨其可能的作用机制,为骨肉瘤的综合治疗寻求新的途径。 实验方法 1.细胞培养：在37℃,体积分数为5%CO2、95%空气、饱和湿度下CO2培养箱内传代培养骨肉瘤U2-OS细胞株,取传代后第3天处于指数生长期细胞用于实验。 2.MTT法测定细胞增殖抑制率：于96孔板内接种培养U2-OS细胞,不同浓度的LiCL分别作用24h、48h、72h后,每孔加MTT10u1,继续培养4h,弃去旧液,加5mh/L二甲基桠枫(DMSO)20ul/孔,待结晶溶解后,用全自动酶标仪(波长490nm)测定每孔的吸光度值A值(OD值),并计算细胞增殖抑制率。 3.细胞核形态学的观察：不同浓度的LiCL作用U2-OS细胞24h后,经染色于荧光显微镜下观察细胞核形态的变化。 4.流式细胞分析：于6孔板内接种U2-OS细胞常规培养,经不同浓度的LiCL作用48h后,将培养液连同用EDTA和胰蛋白酶消化下的骨肉瘤细胞一起离心、清洗,经染色后检测细胞凋亡率并分析细胞周期。 5.不同浓度LiCL作用U2-OS细胞48h后,采用RT-PCR法检测凋亡相关基因Fas(自杀相关因子)、Caspase-3(天冬氨酸特异性半胱氨酸酶)mRNA的相对表达量。 结果 1.MTT结果显示：与对照组相比,各药物组对U2-OS细胞均有增殖抑制作用,差异具有统计学意义(P0.05)；随着药物浓度增高及作用时间延长,细胞增殖抑制率也逐渐增大,经组间比较差异具有统计学意义(P0.05),表明LiCL对U2-OS细胞的增值抑制呈量效和时效关系。 2.倒置荧光显微镜下观察可见：与对照组相比,U2-OS细胞在40mmol/L浓度作用下细胞核固缩变小,染色加深；80mmol/L浓度下可见细胞核膨胀碎裂,150mmol/L浓度下可见明显的核碎裂及凋亡小体。 3.流式细胞仪检测显示：不同浓度药物作用48h后U2-OS细胞凋亡率明显增加且细胞被阻滞于S期。 4. RT-PCR检测结果显示：Fas和Caspase-3mRNA的相对表达量较对照组显著增加,差异有统计学意义(P0.05)。 结论 1.LiCL可明显抑制人骨肉瘤U2-OS细胞增殖并诱导细胞凋亡,且呈量效和时效关系。 2.LiCL抑制人骨肉瘤U2-OS细胞增殖并促进凋亡的机制与凋亡相关基因Fas和Caspase-3的表达增加有关。

【关键词】：氯化锂 U2-OS细胞 增殖抑制 凋亡基因
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R738.1
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