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OSU03012联合Wortmannin对舌鳞癌细胞Tca8113增殖活性及SHIP2蛋白表达的影响

刘纪雷  
【摘要】:背景: 口腔鳞癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一,具有增殖速度快、局部侵袭力强的特点。因此研究口腔鳞癌的增殖、转移及早期预测指标对提高患者的治愈率和生存率具有重要的意义。舌鳞癌是口腔鳞癌中最常见的一种类型;舌鳞癌除了具有头颈部恶性肿瘤的特征外,还具有易向颈部淋巴结转移的特点,舌鳞癌的这些生物学特性,是舌癌术后复发的重要因素,严重影响患者的预后,也给口腔颌面部肿瘤的治疗及预防造成很大困难。 细胞通过各种转导通路所形成的复杂的网络来传递各种增殖及凋亡信号。其中,PI3K/Akt是一个被证实的经典的信号传导通路,在这个信号通路中,磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinosito-13kinase,PI3K)和蛋白激酶B(AKT)是这个信号通路中关键的蛋白分子,AKT的激活通过影响下游多种效应分子的活化状态,在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用,它与人类多种肿瘤的发生发展密切相关。P13K/Akt信号通路在多种人类肿瘤细胞中表达失调,调节着肿瘤细胞的增殖和凋亡,并且与肿瘤的血管形成和侵袭转移也密切相关,因此影响患者的预后,同时也为肿瘤的治疗提供了新的靶点,是目前肿瘤研究的焦点之一。3-磷酸肌醇依赖的激酶-1(PDK1)是Akt的上游关键的活化激酶,它直接影响着AKT的活化程度,从而影响AKT对下游蛋白的调控,包括基因表达调控、细胞周期调控、细胞增殖及分化等。因此,随着其蛋白分子结构及作用机制不断被证实,PDKl在PI3K/Akt信号转导通路中的重要性以及对肿瘤的影响越来越受到关注,以信号通路为靶点的治疗在抗肿瘤方面有广阔的应用前景。 目的: 为了研究PI3K/PDK1/Akt信号通路对舌鳞状细胞癌的增殖及相关蛋白表达的影响,本实验选定一定浓度梯度的PI3K特异性抑制剂Wortmannin和PDKl的抑制剂OSU03012,以体外培养舌鳞癌细胞株Tca8113为研究对象,来分别阻断以及联合阻断PI3K/PDK1/Akt信号通路,来观察对Tca8113细胞增殖抑制的影响,同时检测SHIP2蛋白表达的情况,为舌癌的靶向治疗提供部分理论基础。 材料与方法: 1.细胞株: 人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科实验室惠赠 2.主要材料: RPMI-一1640培养基(含双抗),胎牛血清(杭州四季青公司),Wortmannin(渥漫青霉素)购自美国Sigma公司,以DMSO溶解。PDKl抑制剂OSU-03012购自美国selleckchem公司。SHIP2兔抗人多克隆抗体(c-term)(AP8473e)美国ABGENT公司。 3.方法: (1)用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液(含双抗)为培养基,在37℃、5%CO2的饱和湿度孵箱中培养舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株,每2天换液一次,待细胞生长培养瓶底部约70-80%时,0.25%的胰蛋白酶消化,传代。 (2)应用MTT方法检测Wortmannin和OSU-03012单独及联合应用时对舌鳞癌细胞Tca8113增殖活性的影响。 (3)应用RT-PCR,检测一定浓度的OSU-03012对舌鳞癌Tca8113细胞SHIP2蛋白mRNA表达量的影响。 (4)免疫细胞化学法、western blot(?)去检测一定浓度的OSU-03012对Tca8113细胞内SHIP2蛋白的表达水平变化。 结果: 在MTT检测OSU03012对Tca8113细胞增殖的影响中,在同一时间,随着药物浓度的增加,增殖抑制率逐渐增加。24小时、48小时、72小时时间点各浓度组之间细胞增殖抑制率均存在差异。在同一浓度,实验组随着时间的增加,抑制率逐渐增强。因此,Tca8113细胞随着OSU03012药物浓度增加及作用时间的延长生长受到明显抑制。 在MTT检测Wortmannin对Tca8113细胞增殖的影响中,当Wortmannin浓度低于500nmol/L时,对Tca8113细胞的增殖抑制不明显;在浓度为500nmol和1μmol时,能够对Tca8113细胞产生增殖抑制作用,但随着时间的延长,其增殖抑制无增强的趋势。 在MTT检测Wortmannin (WM)联合OSU03012(OSU)对Tca8113细胞增殖的影响实验中,在相同浓度OSU03012时,联合WM后能够增强对Tca8113细胞的增殖抑制作用。 在RT-PCR检测SHIP2基因mRNA的表达实验中:三组均表达SHIP2的mRNA,其中空白对照组表达水平最高,药物作用组表达水平降低,OSU030125μmol/L组和OSU030128μmol/L组相比较,SHIP2的mRNA表达水平无明显变化。 免疫细胞化学、western blot检测SHIP2蛋白表达实验中:SHIP2蛋白在各实验组均表达,空白对照组表达水平最高,加药组表达水平降低,高浓度药物作用组和低浓度药物作用组比较,无明显差异。 结论 1.OSU03012能够对Tca8113细胞产生增殖抑制作用,其对Tca8113细胞增殖的抑制作用与OSU03012的药物浓度及作用时间呈正关。 2.在浓度为500nmol时,Wortmannin能够对Tca8113细胞产生增殖抑制作用,但随着时间的延长和浓度的增加,其增殖抑制无明显增强的趋势。 3. Wortmannin与OSU03012联合用药时,能够增强对TCA8113细胞抑制增殖的作用。 4.Tca8113细胞内表达SHIP2蛋白;OSU03012药物作用Tca8113细胞后,SHIP2蛋白的表达水平降低。 5. PI3K/PDK1/AKT信号通路在Tca8113细胞的增殖方面发挥着重要作用,OSU03012通过抑制PDK1可以阻断PI3K/PDK1/AKT信号通路。


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