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《郑州大学》 2015年
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乳腺癌血清蛋白标记物的筛选及鉴定

湛玉晓  
【摘要】:背景乳腺癌目前已成为全球女性最常见的恶性肿瘤之一,全球平均每年130万人新患乳腺癌,每年约40万人死于该病,其发病率和死亡率在女性肿瘤中位居第二[1].乳腺癌现已位居我国女性恶性肿瘤的发病率的首位。乳腺癌的发病率随着年龄的增加而升高,绝经后的女性患病率增加。然而,有15%~25%被确诊乳腺癌的女性尚未绝经,大约有7%为年龄在40岁以下的育龄期女性。乳腺癌对患者的身心健康和生活质量产生严重威胁,它的预后与多因素相关,如病理组织学分型、临床分期、是否出现远处转移等。乳腺癌的转移与复发严重缩短了乳腺癌患者的术后生存时间。目前癌症死亡率高的主要原因就是缺乏用于高危人群筛查和早期诊断的具有高敏感性和特异性的生物指标,如能对处于亚临床阶段的乳腺癌做到早期发现,将有助于早期应用有效干涉手段阻止或逆转乳腺癌的发展,从而大大改善乳腺癌患者的预后。虽然血清生物标记分子在乳腺癌的诊断和预后评价中尚无很大作用[2],但是从体液中分析得到的一组有效生物标记分子相比其他临床和病理诊断方法对于疾病的早期诊断或许更有价值且能最大限度降低创伤[3]。因此寻找能用于早期诊断、准确预后判断以及预测治疗反应的新的蛋白标志物对于提高乳腺癌诊断和治疗效果具有重要意义。蛋白质组学能够联系并且反映癌症基因的改变以及细胞生理学变化,因此人们现在逐渐寄希望于利用蛋白质谱分析技术找寻肿瘤蛋白质分子标志物。蓬勃发展的蛋白质谱分析技术,使得高通量的蛋白质组学研究成为可能,也为乳腺癌新的血清生物标记分子的发现提供了更有前景的平台。SELDI-TOF-MS蛋白芯片技术通过比较肿瘤组织和正常组织、或肿瘤患者体液与正常人体液之间的蛋白质谱变化,找出具有差异性的蛋白质,即肿瘤相关蛋白。多数研究者认为,如能根据蛋白质组的变化来预测和诊断疾病,那么其准确性将大大提高。检测疾病的蛋白质组学变化比基因检测和当前一些常规检测更加准确有效。本课题利用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术,以乳腺癌患者和健康女性的血清标本为研究对象,研究乳腺癌术前组与正常对照组、术后组和复发组之间,以及三阴性乳腺癌组与非三阴性乳腺癌组之间血清蛋白质谱变化特征,以寻找相关血清蛋白标记分子,为乳腺癌的早期诊断、疗效评价及不同分子类型预后分析提供一定帮助。目的应用SELDI-TOF-MS技术检测乳腺癌术前组、术后组、复发组与正常对照组血清之间以及三阴性乳腺癌组与非三阴性乳腺癌组血清之间的蛋白质谱,筛选出各组之间具有差异性表达的蛋白质峰,确定某些能够反映肿瘤存在、疗效评价以及恶性程度最高的分子分型与其他分子分型之间预后情况的血清生物学指标。建立更为完善的早期诊断、疗效评估以及预后分析的血清蛋白质指纹图谱模型。材料与方法材料收集自2010年01月至2014年6月郑州大学第一附属医院尚未进行任何治疗的女性乳腺癌患者资料60例,年龄22~69岁,平均44.6+0.3岁,均接受手术治疗,术后病理均证实为乳腺癌。术后按治疗原则接受放疗或化疗,但不列入本次实验考虑因素。60例患者中三阴性乳腺癌患者有22例,术后有11例复发,其中复发患者中有8例为三阴性乳腺癌患者。另收集住院就诊的非乳腺疾病的育龄女性的血清样本20例设为正常对照。实验内容均已详细告知参与实验的患者,且已征得其知情同意。收集所有乳腺癌术前、对应术后2周及术后复发患者的血清标本,各为60例、60例、11例。均在清晨05:00~06:00取血,要求患者在空腹状态下,使用红头干燥管,于室温静置0.5h~1h,离心机离心15~30min,3000 r/min,抽取上清液,标记好信息后于1h内置于-80℃冰箱。方法1).对乳腺癌血清样本的处理:将预先准备好的血清标本放置入冰盒内解冻,溶解后离心3~5min取上清,将点过样的96孔蛋白芯片装入bioprocessor,并做好详细记录,等待检测。2).调置SELDI-TOF-MS系统:利用已知WCX2蛋白质芯片对系统进行校正,保证分子量误差不超过0.1%,并对质谱仪参数、最佳激光强度及最佳灵敏度等进行设定,最高分子量设为30000Da,最佳范围设为2000Da~20000Da。收集初步筛选结果,并通过特定软件进行分析处理,得到各个样本中的m/z峰,通常认为差异0.3%的考虑为同一类。得到初步筛选结果之后,再对不同组间的m/z峰值数据进行Wilcoxon秩和检验,,认为P0.01差异有统计学意义。在肿瘤组与正常组以及肿瘤组不同分型之间得到具有差异性的蛋白峰值,寻找近似值,范围+0.3%。3).聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离纯化血清样本:将处理后的血清样本进行凝胶电泳分离,在对应的分子量轴上切取胶片,进行标记后分装到不同EP管中,按照胶内酶解试剂说明书上的操作步骤,分别进行洗涤、脱色和干燥处理后,加胰蛋白酶进行酶解,得到目标蛋白质。4)目标蛋白质的鉴定:加入提取液,10000r/min离心10-15min后提取上清液,进行点样,放入MALDI-TOF/TOF进行激光轰击,收集到相应的肽段,最后通过Mascot搜索软件,和Swiss Prot数据库进行连接、比对以及匹配,最终得到目标蛋白质。结果1正常组、乳腺癌术前组、术后组及复发组间的比较结果正常组、乳腺癌术前组、术后组、复发组的蛋白质谱数据经过基线减除、去噪、标准化处理和聚类分析后得到各自的峰值,经Wilcoxon秩和检验,共得到4个具有差异性的蛋白峰值(P0.01)。其中有3个在乳腺癌术前组高表达,质荷比(M/Z)分别为6683.8 Da、4695.0 Da、和3983.8 Da,差异0.3%的考虑为同一类,它们在术后组蛋白峰值降低,复发组中又出现峰值的升高;1个在术前组呈低表达,质荷比(M/Z)为1553.1 Da,术后组表达量升高,复发组表达量又复下降。通过SVM回归,筛选出youden指数最高的模型,最终得到m/z峰位于6683.8 Da的蛋白标记物。在正常组低表达,表达强度为118.6+37.5,在术前组高表达,表达强度为898.9+55.9,术后组表达量下降,表达强度为194.7+44.1,在术后复发组又呈高表达,表达强度474.2+83.2。非乳腺癌组与术前组、术前组与术后组、术后组与复发组比较差值均具有统计学意义(P0.01),非乳腺癌组与术后组、术前组与复发组比较差异均无统计学意义(P0.01)。2三阴性乳腺癌组与非三阴性乳腺癌组的比较结果采用SELDI-TOF-MS技术平台对三阴性乳腺组与非三阴性乳腺癌组进行质谱分析,得到具有差异性的蛋白质峰值(P0.01),共筛选出8个,其中有4个在三阴性乳腺癌组高表达,质荷比(M/Z)分别为6683.3 Da、4295.0 Da、1699.3Da和1070.8 Da,表达强度分别为805.4+65.7、732.0+137.7、336.1+90.9、566.3+41.1。通过SVM筛选出youden指数最高的模型,得到m/z峰位于6683.8Da的蛋白标记物,其在非三阴性乳腺癌中表达强度206.3+29.0,其表达在三阴性乳腺癌组和非三阴性乳腺癌组比较差异具有统计学意义(P=0.0016370.01)。3目标蛋白质的鉴定对乳腺癌血清标本中的目标蛋白质进行分离、纯化和酶解后,将所得肽段复合物放入MALDI-TOF/TOF进行激光轰击,最终确定目标蛋白质。质荷比m/z6683.8 Da的蛋白质最终被鉴定为apo C-III(载脂蛋白C-III)。结论1.质荷比(M/Z)为6683.8 Da的蛋白质或肽段经过鉴定为apo C-III(载脂蛋白C-III),可作为乳腺癌的蛋白标记物。2.质荷比(M/Z)为6683.8 Da的蛋白质可辅助鉴别三阴性乳腺癌和非三阴性乳腺癌。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R737.9

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