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《郑州大学》 2017年
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离子束辐照拟南芥生物效应研究

阴悦  
【摘要】:自从上世纪80年代中后期中科院等离子体所余增亮先生提出离子束生物学效应以来,国内外多家机构采用不同的植物和微生物作为研究材料,进行多种离子注入的生物效应和作用机理的研究已取得很大的进展。学者们发现了诸多诱变效应,包括表观性状、生化指标、细胞形态以及分子效应等,以此创造了较大的经济和社会效益。近年来,重离子以其独特的物理核生物学特性而成为了一种备受关注的新型辐射诱变源,由最初的在临床医学应用扩展至在诱变育种中的应用,均收获了不小的成果。伴随着高通量测序技术的快速发展,一种新的方法——RNA-seq技术被广泛应用于生命科学研究,它可以非常有效的定性和定量化分析转录组,因此被广泛应用于基因表达调控领域的研究。通过RNA-seq,可以对材料的基因表达情况进行详细的分析,并且对不同材料间的差异表达情况进行较为详细的展示。本文利用N+低能离子束与12C6+重离子束为辐照离子对新稻18以及哥伦比亚型(Col)拟南芥种子进行辐照处理,通过对辐照后种子培养的幼苗进行表型统计分析来筛选材料进一步实验。通过表型统计分析,发现使用N+辐照材料表型较为混乱,而12C6+辐照结果较为稳定,因此选用12C6+为辐照离子进行深入研究。使用初始能量为80MeV/U,辐照剂量分别为50Gy、75Gy、100Gy、150Gy、200Gy的12C6+离子束辐照拟南芥(Col)种子,通过10天的培养,将所有待测序材料根据表型分析归为生长抑制型YZ(Z75、Z100S、Z150、Z200)和非生长抑制型CJ(Z50、Z100H)进行转录组测序和分析。使用Illumina Hiseq4000平台对6个辐照型(100Gy分两组)和一个野生型对照共7组材料进行测序,每组材料设立3个生物学重复,共计21个样品,每个样品平均产出2.12Gb数据。通过测序数据与参考基因组的比对分析,得到各组材料的基因表达量,再利用其表达量计算基因表达差异情况,可知有39个转录本在YZ各组中表达量均发生了变化,这些转录本经功能注释发现其功能广布于各种生物学途径和基因家族,如光合作用、抵抗逆境胁迫以及转录因子等等;而在CJ各组中共有54个转录本表达量发生变化,其功能注释后的结果除了来自各种生物学途径与基因家族外,还参与了抗逆和转录因子以及代谢相关酶的合成。利用荧光实时定量技术对选取的部分差异表达基因进行验证,验证所选基因差异表达(上调或下调)情况,发现所选基因表达情况均与测序结果相符。最后,通过对100S与100H的部分表型与差异表达基因分析,发现其表达量与对照相比有显著变化的基因大多为代谢和响应外界刺激相关,推测其表型差异的成因为代谢水平的变化引起,其具体的形成机制还有待进一步研究。当前离子束辐照在生物学领域的研究主要包含两点,一是离子束辐照的应用,二是离子束诱变机制的探索。其应用主要有诱变育种以及离子束介导转基因等,目前已广泛被众多研究者所认可;离子束诱变机制作为一个研究难点一直以来受到了各路研究者的重视,但至今尚未给出合理的解释。目前离子束诱变机制的研究主要是从表型、细胞水平以及生理生化水平来开展工作,对分子水平的研究相对较少。本文利用离子束对植物材料进行辐照处理,通过表型筛选、转录组测序,发现离子束辐照后拟南芥表型及基因表达发生变化;利用生物信息技术对测序数据进行分析,筛选出差异表达相关基因并利用分子生物学方法进行验证,对认识离子束诱变机理具有理论意义,在下一步实验工作中具有指导意义,对进一步研究离子束诱变机制提出了一种研究方向与可能。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q947

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