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DJ-1对缺氧性肺动脉高压的作用及其分子机制的研究

高崴崴  
【摘要】:背景缺氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary arterial hypertension,HPH)是由持续性缺氧引起的肺血管收缩,重构及肺血栓形成等病理损伤,并最终导致血流动力学异常甚至右心衰竭的疾病。HPH在临床上比较常见,但至今并没有较好的治疗方法,其发病机制复杂,涉及多个途径,并有多种血管效应分子促其发生。HPH的病理特征肺血管收缩以及肺血管重塑已经非常清楚,在此过程中肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)起到关键作用。PASMCs的过度增生、迁移以及表型从分化型向去分化型的转换,造成肺血管壁的增肥增厚,最终导致肺动脉压力与肺血管阻力增强,因此,PASMCs的过度增殖和迁移被认为是肺血管重构的关键过程而成为学者们研究的热点,其分子机制可能牵涉遗传因素、分子介质和细胞异常等多个途径,血管内皮细胞功能受损、炎症反应和免疫异常等参与其形成,多种血管活性物质失衡促进其发生,最终导致肺血管收缩和肺血管结构重建。DJ-1,别名Park7,在体内各组织中广泛存在,虽然是胞浆蛋白,但在细胞核与细胞质中均有表达。其最早作为帕金森综合征的突变基因被熟知,此外,DJ-1在多种细胞中具有生物学特性,与转录调控、氧化应激和癌症的形成等密切相关,并能够通过线粒体途径保护心血管。有文献报道,DJ-1能够调节小凹蛋白caveolin-1(Cav-1)的表达,但其在HPH中的作用尚未有报道。小凹(caveolae)是细胞膜上特殊的囊泡状凹陷,其主要成分为小凹蛋白caveolin,其中Cav-1在多类细胞中均有表达,在信号转导途径中发挥着重要的作用。有研究表明,Cav-1在特发性肺动脉高压病人的体内表达降低,可作为特发性肺动脉高压的生物学标记物,已经成为肺动脉高压病理过程中不可或缺的分子。因此,我们推测DJ-1和Cav-1在HPH发病过程中互相作用并影响肺动脉高压的病理过程。目的该课题拟利用持续低氧环境构建缺氧性肺动脉大鼠模型,检测其血流动力学特征以及组织中DJ-1和Cav-1蛋白水平的表达;将DJ-1过表达载体和Cav-1沉默载体分别感染低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞,分别检测其对肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移、钙离子浓度和细胞表型转化的影响。探索DJ-1和Cav-1在缺氧性肺动脉高压中发挥的作用及其潜在的分子机制,为缺氧性肺动脉高压的临床治疗提供新的靶点和理论依据。方法1、DJ-1和Cav-1在缺氧性肺动脉高压大鼠模型中的表达情况。将野生型和DJ-1敲除型大鼠在含氧10%的低氧仓中饲养,4周后即可建立缺氧性肺动脉高压模型;常氧组大鼠在常氧条件下饲养,期间大鼠正常饮水、进食。模型构建成功后分别检测其血流动力学指标,免疫蛋白印迹法检测DJ-1和Cav-1蛋白的水平。2、DJ-1过表达和Cav-1沉默对缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞的影响。将PASMCs进行缺氧处理,并分别感染DJ-1过表达和Cav-1沉默载体,通过MTT法检测细胞增殖、Transwells小室检测细胞迁移、Fluo3-AM检测钙离子浓度、免疫蛋白印迹法检测表型转化标志蛋白水平等的检测,探索DJ-1对缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞的影响。3、DJ-1过表达对ERK1/2和TGFβ1/Smad信号通路的调控。DJ-1过表达或者Cav-1沉默处理缺氧诱导的PASMCs,通过免疫蛋白印迹法检测缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞中通路分子的表达,研究DJ-1和Cav-1在缺氧性肺动脉高压中潜在的分子机制。结果1、证实DJ-1和Cav-1在缺氧性肺动脉高压大鼠模型中异常表达。持续的缺氧环境成功构建了缺氧性肺动脉高压大鼠的模型,通过检测,其组织中DJ-1和Cav-1的表达水平均显著降低,另外在DJ-1敲除型大鼠中,缺氧诱导之后肺动脉高压的症状更为显著,表明DJ-1可能在肺动脉高压病理过程中发挥着重要的作用。2、发现DJ-1能够调控缺氧诱导的PASMCs生物学功能并且通过Cav-1实现。对缺氧诱导的PASMCs分别进行了 DJ-1过表达和Cav-1沉默处理,结果表明,缺氧处理PASMCs之后,细胞增殖迁移增加,胞内钙离子浓度升高,细胞从分化型转化为去分化表型,而DJ-1过表达之后能够抑制缺氧诱导的PASMCs增殖、迁移、钙离子浓度升高以及细胞表型转换。另外,Cav-1蛋白的沉默反转了 DJ-1对缺氧诱导的PASMCs的作用,因此我们推测,DJ-1可能是通过Cav-1对PASMCs的损伤发挥保护作用。3、初步证明DJ-1可能通过Cav-1抑制ERK1/2和TGFβ 1/Smad通路的激活。通过对PASMCs感染DJ-1过表达载体和Cav-1沉默载体,深入研究了 DJ-1影响缺氧诱导的PASMCs增殖迁移等过程的分子机制,结果表明,缺氧诱导PASMCs之后,ERK1/2和TGF β 1/Smad通路均被激活,而DJ-1过表达之后,通路的激活被抑制,相反的,Cav-1沉默之后,DJ-1的作用被反转,因此我们推测DJ-1可能通过上调Cav-1的表达抑制ERK1/2和TGFβ 1/Smad信号通路,从而抑制缺氧造成的PASMCs增殖、迁移、表型转化和胞内钙离子含量的升高。结论1、DJ-1和Cav-1蛋白在HPH大鼠模型肺组织中的表达较正常组大鼠均显著下降;DJ-1和Cav-1蛋白在缺氧诱导的PASMCs中的表达较常氧组细胞均显著下降;2、DJ-1过表达能够抑制缺氧诱导的PASMCs增殖、迁移、钙离子浓度升高以及细胞表型转换;而Cav-1的沉默促进缺氧诱导的PASMCs增殖、迁移、钙离子浓度升高以及细胞表型转换;DJ-1过表达和Cav-1沉默共处理之后,DJ-1对缺氧诱导的PASMCs的影响被反转;3、DJ-1过表达抑制ERK1/2和TGFβ1/Smad信号通路,且其作用在与Cav-1沉默载体共处理之后被反转。综上所述,DJ-1可能通过上调Cav-1的表达抑制ERK1/2和TGFβ1/Smad信号通路进一步抑制缺氧造成的PASMCs增殖、迁移、钙离子浓度升高以及细胞表型转换。


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