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《郑州大学》 2002年
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癌胚抗原DNA疫苗的构建及佐剂对其免疫效应的影响

杨璇  
【摘要】: 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen CEA)是一种最常见的肿瘤相关抗原(TAA),也是国际上公认的肿瘤标志物,于1965年首次在人结肠癌和胰腺癌中发现,1987年克隆出它的全长基因序列。它是一种分子量约为180kd的糖蛋白分子,胚胎时期可正常表达分泌,并对胚胎的发育、组织形成及发展具有重要的作用。成年后,CEA的表达消失,但在胃肠道恶性肿瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌和乳腺癌等癌细胞表面又可重新表达CEA,所以在成年人体内,CEA可作为肿瘤检测和治疗的靶分子。上述肿瘤细胞表面虽有CEA分子,但并不能激起机体针对CEA的特异性免疫应答,所以这些肿瘤细胞能逃避机体的免疫监视,发展成肿瘤。 九十年代初,一种新型的疫苗-DNA疫苗的出现为解决CEA的免疫原性,打破机体免疫耐受提供了新的途径,同时也为CEA阳性肿瘤的治疗提供了新方法。核酸疫苗是指将含有编码肿瘤相关抗原基因的真核表达质粒,直接接种到动物体内,然后被动物细胞摄取并表达出相应的抗原,通过不同途径刺激机体产生针对该抗原的免疫应答,从而消除或抑制肿瘤细胞的生长。1994年,Conry 郑州大学医学院2002研究生毕业论文 癌胚抗原**A疫苗构建及佐剂对其兔疫效应的影响 就构建了 CEA DNA疫苗,并在动物体内诱导产生了良好的兔疫效 果。学者们为了增强DNA疫苗的免疫效果,主要采取以下措施: 1.免疫局部处理;2.应用高效、安全的表达载体;3.在DNA免 疫中引入细胞因子或粘附分子;4.在疫苗中引入免疫刺激序列。 本文运用基因工程技术构建了CEA的DNA疫苗PC工Cn,白细 胞介素七的真核表达质粒PCI可L《,设计合成了硫代修饰的免 疫刺激序列门SS),希望从载体、细胞因子和ES方面提高 CEA 的表达和抗{EA的产生,从而达到对优A阳性肿瘤免疫防治的目 的。 材料和方法: 1.PCI{n的构建制备和定量:ECORI酶切含仍A全基因的质粒 pGEM。-CEA,琼脂糖电泳回收2.4kb的片段,与经ECORI 酶切的 真核表达质粒 pCI丁eo在 T4连接酶作用下连接,转化 DHS u菌, KR法筛选重组质粒,然后经*ajnH工、Bg1H不对称酶切鉴定 2.4kb片段正确插入,命名为 pCI-CEA。重组质粒转化 DHS u, 大量培养后,碱裂解法提取质粒,聚乙二醇法纯化,紫外分光 光度法测量DNA纯度并定量。 2.PCI-IL-2的构建:用oligo 软件设计弓物,在上、下游引物的 5’端加上Xhol和 Sail酶切位点,以便于与载体连接。PCR法 扩增几亿片段,在T4连接酶的作用下与 Xhol和 Sal工酶切的 pCI-neo载体连接,PCR法鉴定重组体,用 Xho工,Xhol+Sal, Ban工工酶切进一步验证重组体,命名为pCllL-2。 3.DM免疫:对0.*%的布比卡因注射入Mn几小鼠胜前肌,在 _2_ 郑州大学医学院2002研究生毕业论文 癌胚抗原**A疫苗构建及佐剂对其兔疫效应的影响 注射后第 3大分别接种浓度为 in g/ul的 CEA DNA疫苗及相应 佐剂口SS或 gIL《厂每侧 50 u g,每组 5只小鼠,对照组注射 50 yi的PBS缓冲液。然后在第10、24大分别再免疫两次。 4.CEA DNA疫苗在体内诱导小鼠产生抗{EA及 CEA的表达:于 DNA疫苗末次免疫后第1、2、4、6周分别采集小鼠血液以ELISA 方法检测小鼠血清中抗{EA和 CEA。实验数据用 SPSS10.0软件 分析比较其差异显著性。 结果: 1.构建的 pCI-CEA,经ECORI酶切后获得2.4kb和 5.4kb的片段, 经 BalnHI 酶切后获得 3.okb和 4.skb片段,经 Bglll 酶切后获 得0.4kb和 7.4kb片段,与理论值一致。 2.构建的pCI-IL-2,经PCR扩增阳性,经XhOI酶切后获得6.Zkb 的片段,经 Xho工和 Sail酶切后获得 0.skb和 5.4kb片段,经 Banff酶切后获得 0.gkb.1.3kb和 3.Zkb片段,证明是所要构 建的质粒。 3.DNA免疫后,CEA的表达:pCI-CEA组明显高于 pcDNA。-CEA组, 检验差异有显著性。PC工-IL-2和 ISS未能增加 CEA的表达。 4.抗-CEA的产生:pCI-CEA组高于pCDNA。-CEA组,检验差异有显 著性。ISS和白细胞介素-2质粒(PIL-2)均能增强抗-CEA分泌。 本实验结果表明:载体、细胞因子和 ISS能增加 DNA疫苗的免 疫效果,但如何增加 DNA疫苗的抗原表达量仍需探讨更为有效的 方法。本实验为进一步提高 CEA DNA疫苗的免疫效果、作用机制 及影响因素提供了实验依据,为进一步研究DNA免疫提供了参考。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R392

【参考文献】
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