结核分枝杆菌体内诱导抗原初步研究

【摘要】： 全世界已有近20亿人感染过结核分枝杆菌，每年有新发病例1000多万，300万人死亡，世界卫生组织在1993年和1997年两度发出警告。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，结核病患者数量居世界第二位，据2000年全国结核病流行病学调查，我国现有结核杆菌感染者4亿人，结核病患者500万人，其中传染性肺结核病患者200万人，每年因患结核病死亡的人数达13万人，严重危害人民群众的生命健康。 病原体在宿主体内诱导表达的基因在其致病过程中起关键性作用，这些功能基因被称为体内诱导基因(in vivo induced gene，ivi gene)。体内诱导基因及其产物的研究很有可能为新的疫苗、诊断试剂和抗菌药物的开发提供新的目标。体内诱导抗原技术(in vivo-induced antigen technology,IVIAT)是一个近两年刚出现的一个研究体内诱导基因的方法，它不使用动物模型，直接利用患者血清来探查病原体在患者体内特异表达的抗原基因，与以往研究病原体体内诱导基因的方法相比更加简便、准确。 结核分枝杆菌的体内诱导基因的研究很少，国内外尚无相关文献。本研究拟利用体内诱导抗原技术，找到一些结核分枝杆菌的体内诱导基因，并分析它们的功能，从而进一步了解结核分枝杆菌致病的具体机制，为将来发现新的药物靶标，研发新的疫苗和诊断试剂提供一些新的线索。 方法 1．结核分枝杆菌基因组表达文库的构建：提取结核分枝杆菌基因组染色体，用Sau3A Ⅰ不完全酶切，回收1-4kb基因组DNA片段。限制性内切酶BamH Ⅰ酶切 郑州大学硕士学位论文 结核分枝杆菌体内诱导抗原初步研究 原核表达载体pKK223一8，回收线性载体。将上述两种DNA片段进行连接反应，电 击转化大肠杆菌DH5a，之后鉴定文库。 2.结核分枝杆菌基因组表达文库的筛选:收集感染人型结核分枝杆菌患者血 清，用大肠杆菌DH5a和人型结核分枝杆菌超声产物吸附病人血清，采用菌落原 位免疫的方法筛选文库，寻找阳性克隆。 3.体内诱导抗原基因的序列分析:将筛选到的阳性克隆提取质粒，按照表达 载体插入位点两侧的质粒DNA序列设计并合成测序专用引物，对插入片段进行 测序，以测得序列为基础，用BLAST软件在Genbank上搜索同源序列。 结果 1.构建了人型结核分枝杆菌基因组表达文库，文库容量1.02 x104，已满足了 我们研究工作的需要，为进一步筛选结核杆菌体内诱导基因莫定了良好的基础。 2.采用体外培养的大肠杆菌DH5a和结核分枝杆菌超声产物与患者血清共温 育的方法处理血清，筛选近7000个文库克隆，获得28个阳性克隆。 3.对阳性克隆中外源DNA插入片段进行测序，在Genbank上进行BLAST， 找到与人加‘口bacterium Tuberculosis H37Rv菌株高度同源的ORF共巧个，按功 能可分为以下五类:脂类代谢、中间代谢、细胞壁、假想蛋白、结构蛋白等。经 验证，初步认为这巧个基因可能为人型结核分枝杆菌的体内诱导抗原基因。 结论 1.本研究在国内首先利用体内诱导抗原技术，率先找到了15个人型结核分枝 杆菌体内诱导抗原基因，为进一步分析其功能打下了基础，并为结核病防治研究 带来新的机会。 2.IVIAT是一个崭新的研究体内表达基因的方法，快速、简便，无须使用动 物模型，仅使用常规的免疫学和分子生物学实验方法，是研究病原微生物体内 诱导基因的一个很有价值的手段。