子宫内膜癌孕激素受体B亚型基因启动子区CpG岛甲基化的研究

【摘要】： 近年来，肿瘤组织中抑癌基因启动子区CpG岛的异常甲基化成为肿瘤研究领域中一个新的研究热点，认为是除突变、缺失以外导致抑癌基因失活的第三条通路。子宫内膜癌是女性生殖道常见肿瘤之一，虽然随着诊疗水平地提高，早期患者5年生存率最高可达80～90％，但期别晚分化差的内膜癌患者5年生存率只有5-15％，合并雌孕激素受体失表达者预后更差，而且孕激素受体失表达常常使得这部分患者的孕激素治疗难以奏效，所以子宫内膜癌孕激素受体的失表达及其发生机制备受关注。在孕激素受体亚型水平上，有研究表明孕激素受体B亚型(progesterone receptor B，PRB)在子宫内膜癌中的失表达率明显高于A亚型(progesterone receptor A，PRA)，并导致拮抗雌激素效应能力的下降，而在探讨PRB失表达机制的研究中尚未见到基因突变缺失的报道。对此，国外学者就第三条抑癌基因失活途径探讨了子宫内膜癌中PRB失表达的原因，发现PRB基因启动子区存在CpG岛甲基化，并在多种PRB失表达的子宫内膜癌细胞系上以去甲基化试剂成功诱导了PRBmRNA复表达。国内尚无此类研究的报道。本研究采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)的方法对子宫内膜癌患者癌组织中PRB基因启动子区CpG岛甲基化发生率进行了检测，并在蛋白水平上观察经去甲基化试剂处理后，PR阴性的子宫内膜癌细胞系Heccl-1(human endometrial carcinoma cell line-1)PRB的表达状况的改变，从而间接探讨子宫内膜癌PRB失表达机制，并为去甲基化药物应用于子宫内膜癌的临床治疗提供实验依据。 郑州大学2003年硕士研究生毕业论文子宫内膜癌孕激素受体B亚型基因启动子区CPG岛甲基化研究 2.材料与方法 2.1材料26例子宫内膜癌标本来自郑州大学医学院第一附属医院1997一1999年归 档的石蜡块。7例正常子宫内膜来自同期因子宫肌瘤手术切除子宫内膜之石蜡块标 本。HecC卜1子宫内膜癌细胞系来自山东省肿瘤防治研究院2000年自建细胞系，其 PR阴性。本实验用细胞系为Heccl一第63代细胞。 2.2方法 2.2.1子宫内膜癌组织PRB基因启动子区CPG岛甲基化发生率检测:利用UNI奋10柱式 小量基因组DNA抽提试剂盒提取石蜡切片中的基因组DNA后，采用甲基化特异的PCR方 法检测PRB基因启动子区CPG岛甲基化状况。该方法应用亚硫酸氢钠处理基因组DNA， 将所有无甲基化修饰的胞嗜淀转变为尿嗜睫，而尿嗜陡在后续的PCR中被胸腺嗜吮取 代，此过程中甲基化胞嗜睫维持不变。据此变化，于富含CPG的PRB启动子区，设计 出针对存在CPG甲基化DNA特异敏感的引物PRB一M，以亚硫酸氢盐处理过的DNA为模板 进行扩增。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳，澳化乙睫染色，紫外光透射下观察来鉴定 根据特异性产物的有无来确定目的DNA区域CPG的甲基化情况。 2.2.25杂氮脱氧胞昔对Heccl一子宫内膜腺癌细胞系PRB表达影响的研究:取第 63代Heeel一l细胞系，选IMDM(iseove modified dulbeeeo medium)为培养基，于 第1、3、5天加用甲基转移酶抑制剂5杂氮脱氧胞昔，药物终浓度分别为1“g/m1、 2 pg/ml、4协g/ml、8，g/ml，第2、4天更换为无药培养基，同时设立PBS代替药 物的试验对照组，第6天收获细胞，制备单细胞悬液，每组取8张滴片丙酮固定后 采用抗PRB的单克隆抗体按常规免疫组化的方法检测Heccl一1细胞系PRB蛋白表达 状况。与PBS代替一抗的空白对照相比，胞核部位出现明显的棕黄色信号为表达PRB 蛋白的典型阳性细胞，每个滴片在高倍镜下计数100个细胞，典型阳性细胞5%为阴 性滴片，典型阳性细胞数占5一5既为阳性滴片，典型阳性细胞50%为强阳性滴片。 2.3统计学方法:采用SPSS统计软件包四格表精确概率法及成组设计多个样本比 较的秩和检验方法进行统计处理，以Q=0.05作为检验水准。 2 郑州大学2003年硕士研究生毕业论文子宫内膜癌孕激素受体B亚型基因启动子区cpG岛甲基化研究 3.结果 3.1 26例子宫内膜癌患者其癌组织中13例存在PRB启动子区CpG岛甲基化，7 例正常子宫内膜组织无一例存在PRB基因启动子甲基化，两组比较差异有显著性 (只Q .QS)。 3.2 15例中、低度分化的子宫内膜癌患者组中n例存在PRB基因启动子区CPG岛 甲基化，高分化内膜癌患者组n例中有2例存在该甲基化现象，两组比较差异有显 著性(尸0 .05)。在有无淋巴结转移，有无肌层浸润及各病理类型组别间，该甲基 化发生率无统计学差异(尸0 .05)。 3 .3药物处理前及PBS代替药物的实验对照组Heccl一l细胞系PRB蛋白检测均为阴 性。 3.45杂氮脱氧胞昔不同药物终浓度的Heccl扭细胞系实验组PRB蛋白均呈不同强 度的表达，与实验对照组之间比较差异有极显著性(只0.001)，各处理组之间PRB 表达强度差异无显著性(尸0 .05)。 4.结论 4.1 PRB基因启动子区C两岛甲基化在子宫内膜癌的发生发展中为一频发的重要分子 事件，该甲基化发生率与中低分化的子宫内膜癌相关。 4.2子宫内膜癌细胞系Heccl一1的PRB失表达可{以被去甲基化药剂5杂氮脱氧胞昔 逆转而重新恢复表达。 提示子宫内膜癌患者癌组织中PR