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《郑州大学》 2003年
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分化诱导剂对Eca-109细胞DNA聚合酶β及其相关基因表达的影响

李士坤  
【摘要】: 目的:DNA聚合酶β在DNA的损伤修复中起重要作用,主要参与DNA碱基切除修复,一般不参与DNA的复制。有研究表明正常细胞中的DNA聚合酶β在整个细胞周期中都是低表达的,高表达的DNA聚合酶β可能在DNA合成中与其它DNA聚合酶竞争而参与DNA的复制。而DNA聚合酶β是真核生物DNA聚合酶中复制保真性最差的酶,它过多的参与DNA复制会引起基因组的不稳定性,导致肿瘤发生。各种肿瘤组织中DNA聚合酶β表达增高已有很多报道。我们曾对人食管癌组织的DNA聚合酶β进行研究,发现癌及癌旁组织中DNA聚合酶β的表达明显高于正常组织,提示DNA聚合酶β的表达改变可能是食管癌癌变的早期事件。但在恶性细胞的逆转化过程中DNA聚合酶β是如何变动的,尚未见报道。本实验以8-溴-cAMP及槲皮素作为分化诱导剂处理人食管癌Eca-109细胞,以PCNA、VEGF、EGFR、c-myc等基因表达作为恶性生物标志观察人食管癌Eca-109细胞的诱导分化效应,探讨DNA聚合酶β以及与其共同在碱基切除修复中起作用的XRCC1(X-射线修复交联-补充蛋白)、wtp53等基因在细胞逆转化过程中的改变及其意义。 材料和方法:人食管癌Eca-109细胞由郑州大学医学院分子细胞生物研究中心提供,含野生型DNA聚合酶β(wtpolβ)cDNA的pcDNA.3质粒由病理生理实验室构建提供,经双酶切获得wtpolβcDNA:野生型p53 (wtp53)cDNA、c-myc cDNA、EGFR cDNA(8.5kb)均购于北京大学分子生物学研究中心。贴壁培养人食管癌Eca-109细胞,传代后分成三组:(1)加8-溴-cAMP(Br)组;(2)加槲皮素(Q)组;(3)不加任何药物对照(C)组;同时培养48h后收集细胞,分别制成细胞滴片,硝酸纤维素膜点和提取总RNA。将polβcDNA,EGFR cDNA分别用 郑州大学2003硕士生毕业论文 分化诱导剂Eca一109细胞的DNA聚合酶日及其相关基因表达影响 随机引物法制成生物素标记的cDNA探针;wtp53cDNA及c一myc cDNA探针由郑 州大学医学院分子细胞生物研究中心提供。进行3组细胞的原位杂交和RNA斑 点印迹阵列。另进行DNA聚合酶p,XRCCI,VEGF及PCNA的免疫组化染色及免疫 斑点印迹阵列。印迹阵列皆用岛津薄层色谱扫描仪(T LC)进行波长523nln的扫描 数值比较。 结果: 1.观察生物素标记的探针杂交信号:polp的杂交信号呈兰紫色细颗粒,定位于胞 质。两实验组细胞(Br组及Q组)杂交信号弱于对照组,两实验组杂交信号分别 与对照组相比差异有统计学意义(只0.05)。诚p53的杂交信号呈兰紫色细颗粒分 布于胞质,两实验组细胞杂交信号明显强于对照组,分别与对照组相比差异有统 计学意义(只0.05)。 2.RNA斑点印迹显示:与对照组相比:Br组的DNAPolp,EGFR及c一myc的RNA斑 点的TLC扫描数值分别下调了5倍,6.5倍,2.5倍,而讯p53基因表达则上调 了2.5倍;Q组的DNAPolp,EGFR及e一mye的RNA斑点TLe扫描数值分别比对 照组下调了6.5倍,7倍,2.2倍,而诚p53的RNA斑点的TLC扫描数值则比对 照组上调了2.2倍。 3.免疫组化染色观察:DNAPolp一工R、XRCcl一IR皆呈棕黄色颗粒,主要定位于 细胞核,两实验组细胞(Br组及Q组)免疫反应弱于对照组,两实验组免疫反应 分别与对照组相比差异有统计学意义(只0.05)。两实验组之间差异无统计学意义 (乃0 .05)。 4.免疫斑点印迹显示:Br组DNA聚合酶p一IR,XRCCI一IR,PCNA一IR及VEGF一IR 的TLc扫描数值分别比对照组低4.5倍,4.5倍,5倍和4.5倍;Q组DNA聚 合酶p一IR,XRCCI一IR,PCNA一xR及VEGF一IR的TLC扫描数值分别比对照组低 4.0倍,4.5倍,5.5倍和3.5倍。 结论: 1.8一澳一cAMP及棚皮素可下调作为肿瘤细胞恶性程度生物学指标的PCNA、VEGF、 EGFR、c一myc等的表达,上调佩p53的表达,表明对人食管癌Eca一109细胞具有一 定的诱导分化效应。 2.在人食管癌Eca- 109细胞逆转化后,其DNA聚合酶p及XRCCI的表达下调,提 郑州大学2003硕士生毕业论文 分化诱导剂Eca一109细胞的DNA聚合酶日及其相关基因表达影响 示人食管癌Eca一109细胞的DNA聚合酶p和XRCCI是高表达的。 3.DNA聚合酶p及XRCCI的表达与Eca一109细胞分化有关。 4.高表达DNA聚合酶p可导致恶性变表型,诱导剂可下调DNA聚合酶p基因表达 提示它具有对肿瘤治疗的应用意义。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R735.1

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