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《郑州大学》 2003年
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小叶丁香组织(细胞)培养合成橄榄苦甙

吴鸣建  
【摘要】:小叶丁香(Syringa pubescens Turcz.)为木犀科(Oleaceae)丁香属(Syringa)野生植物,研究发现,其中的主要活性成分为属于裂环环烯醚萜甙类化合物的橄榄苦甙。经药理与动物实验结果表明,橄榄苦甙具有抗菌、抗病毒、抗真菌、抗氧化、抗癌、抗肝纤维化的显著作用,且毒性很低,是一个很有潜力的活性化合物。 本论文通过硅胶柱层析并结合薄层层析,从小叶丁香的原植物中分离得到了裂环环烯醚萜甙类化合物——橄榄苦甙(oleuropein)、10-羟基橄榄苦甙(10-hydroxyoleuropein)、oleoside-11-methyl ester和芳醇类的2-(3,4-二羟基苯基)乙醇[2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethanol],以及黄酮类化合物。通过硅胶柱层析并结合薄层层析和制备高压液相,从培养得到的愈伤组织中分离鉴定出目标次生代谢产物橄榄苦甙。建立了测定橄榄苦甙含量的RP-HPLC法,并且利用这种方法测定了小叶丁香的不同部位——花、叶、茎和根之中的橄榄苦甙的含量;测定了不同条件下培养所得的培养物中橄榄苦甙的含量;测定了伴生菌培养物中橄榄苦甙的含量。其中在75%C_2H_5OH回流提取条件下,小叶丁香花中橄榄苦甙的含量为14.88mg/g;根部为7.21mg/g;叶中为6.09mg/g;茎为4.19mg/g,实验结果证实花是小叶丁香中橄榄苦甙含量最高的部位。 本论文经过300多次实验,2000多个试样的诱导、培养、观察和数据测定,开展的工作和取得的结果如下: 1.建立了小叶丁香的愈伤组织培养体系和悬浮细胞培养体系 首次选择小叶丁香的叶片、叶芽和嫩茎等不同部位作为外植体,利用植物组织(细胞)培养技术,在添加相应的植物生长调节剂的LS、MS等培养基上成功地诱导产生出愈伤组织,其中叶片最容易诱导产生愈伤组织,其次为芽和嫩茎。考察了不同的培养基、植物生长调节剂、外植体的不同部位和不同时间等诱导条件对于愈伤组织的诱导率、生长状况和形态的影响,测定细胞生长周期,建立了 摘要 小叶丁香的愈伤组织培养体系和悬浮细胞培养体系。在添加植物生长调节剂KT、 2,4一D、NAA的LS或MS培养基上,选用小叶丁香外植体,在光照10hr/d,温 度25℃,诱导时间为7一10d的条件下能够产生愈伤组织,诱导率为:叶芽 茎,愈伤组织细胞生长周期约为40一45天。在光照10hr/d,温度25℃,摇床 转速110~120 rpm/min条件下,采用添加KT 1 .Omg几和NAA 1 .Om留L的Ls 液体培养基,悬浮细胞生长周期约为28一35天。 2.得到了较好的培养条件 全面、 碳源、氮源 系统地研究了小叶丁香植物组织(细胞)培养体系中有关培养基中的 植物生长调节剂、pH值、不同培养基、不同接种量、继代周期、 培养温度、光照时间,以及紫外线(uv)、水杨酸(SA)和推测前体(I)诱导等 各种因素对愈伤组织细胞生长和目标次生代谢产物生产与积累的影响,并通过均 匀设计法进行了植物生长调节剂与培养基成分的优化实验,综合比较得到较好的 培养条件和实验结果。即培养基和植物生长调节剂的组成与用量为(m留L): MgS04 370、KHZPO;255、KN03 1805、NH4NO3 2145、CaC12 396、硫胺1.2、 肌醇115、H3B039.30、MnS0420.28、ZnSO;10.32、NaMoo;0.288、CuSO;0.0275、 CoC12 0.0263、Kl 0.789、N助EDTA 33.570、FeS04 23.63、KT 0.80、2,4一D 3.30、 NAA 1 .05;蔗糖3Og/L;光照10hr厄;培养温度25℃;pH 5.5;接种量ZOg/L; 继代周期42d及适当的诱导因子如UV、SA、前体(I)。培养物中橄榄苦贰的含 量达到1.4Om眺。 3发现了生产橄榄苦贰的小叶丁香伴生菌并进行初步实验 首次发现并利用小叶丁香根得到的伴生真菌进行培养,选用两种培养基(LS 培养基和察氏培养基)进行比较、研究、观察其生长状况和形态,并对伴生菌的 培养物用RP一HPLC法证明了橄榄苦贰的存在。初步进行了有关培养基、培养条 件和培养继代的研究。由于伴生真菌具有生长速度较快,继代时间短,相对可行 性较好等特点,具有良好的发展前景。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:O629

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