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人食管癌Eca-109细胞膜肿瘤抗原筛选的研究

李付广  
【摘要】:目的: 肿瘤疫苗(tumor vaccine)是指给机体直接或间接输入的具有抗原性的成分,它可刺激机体免疫系统产生抗肿瘤免疫效应,用于治疗肿瘤。肿瘤细胞的抗原(antigen,Ag)绝大部分为细胞膜蛋白。收集其进行研究,对于寻找高效肿瘤抗原具有重要意义。本研究采用改良的Neville法和弱酸洗脱法收集不同分子量的人食管癌细胞株Eca-109细胞膜蛋白,寻找能引起免疫反应的肿瘤抗原,筛选出高效肿瘤抗原的大致范围,为食管癌的免疫治疗提供依据。 方法: 1.提取Eca-109细胞膜蛋白:使用改良的Neville法先提取细胞膜。然后在pH 6.3的条件下,用去垢剂(detergent)Triton Ⅹ-100和辛基β-葡糖苷(octyl β-glucoside),把细胞膜上的蛋白溶解下来,以超滤法纯化膜蛋白并分组。 2.以超滤法纯化膜蛋白并分组:以超滤法将膜蛋白从以Triton Ⅹ-100作去垢剂的成分中按分子量大小分出<3KD、3~10KD、<10 KD、10~30 KD四个组;从以辛基β-葡糖苷做去垢剂的成分中分离出30~100 KD、>100 KD两个组,并测定各组膜蛋白浓度。 3.测定膜蛋白的浓度:用Bradford检测法,在pH 6.3、波长595nm处,制作蛋白标准曲线,测定含有去垢剂的各组膜蛋白浓度,推导出适当的去垢剂与膜蛋白之比(即mg去垢剂/mg膜蛋白)。 4.检测Eca-109细胞的HLA表型及筛选健康志愿者:使用HLA引物试剂盒,琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)观察聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增后的DNA产物,鉴定出Eca-109细胞的HLA表型。采用血清学HLA分型技术,寻找至少有一个HLA Ⅰ类基因位点与Eca-109细胞HLA相匹配的健康志愿者。 5.人外周血DC的培养:取筛选出的志愿者的外周血,密度梯度离心法获得外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),用含粒细胞-巨噬 郑州大学2004年博士学位论文 人食管癌Eca一109细胞膜肿瘤杭原筛选的研究 细胞集落刺激因子(granuloeyte一macro坤昭e eolo妙stimulati飞factor, GM一CSF)、白 细胞介素一4(inierieukin一4,IL一4)及该志愿者血清的即Ml 1640培养液调整细胞密 度后,加入24孔板中培养。于培养的第4天,根据一定比例加入膜蛋白,第6 天加入LPS促进DC成熟,于第7天收获成熟的悬浮DC。 冷冻保存抗原负载的成熟DC:含有10%DMSO和5%葡萄糖的纯自身血清 作为冻存液,可以将密度为10 xl护/ml抗原负载的成熟DC,以每分钟降温1℃, 放置于液氮的气相中保存。 6.人外周血T细胞的培养:在IL一2维持下,流式细胞仪检测此志愿者PBMC 的分化情况。根据检测结果,再收获PBMC,经过换培养瓶及PHA刺激,以含 hIL一2的RPMI 1 640培养液常规培养PBMC4周,收集纯化的T细胞。 7.MTT法测定致敏T细胞的细胞毒活性:以纯化的T细胞为效应细胞,加 入抗原负载的成熟DC,以8:l、16:l、32:l的效靶比分别加入Eea.1 09细胞(其 为靶细胞);同时设阳性对照组、阴性对照组及效应对照组,各组设3个复孔, 用MTT法在%孔板中测定CTL的细胞毒活性。 8.弱酸洗脱法:单层生长的Eca一109细胞每天按如下方法处理:去掉培养液, PBS洗三次,每瓶加5ml构椽酸一磷酸盐缓冲液(pH3.3)室温作用lmin,使MHC 分子变性,释放MHC分子结合的肤入上清液。肿瘤细胞经PBS洗3次,用培养 液继续培养。每瓶细胞最多酸洗3次弃去。含有肤的酸洗液经过seP一Pak C18柱 脱盐、真空浓缩和Microeon YM·3(Millipore)超过滤,一ZooC冻存。 9.反相高效液相(RP一HPLC)分析:Eca一109细胞细胞膜酸洗肤用HPLC分 离,流速lml/min,用O%~70%梯度(v八护)0.085%TEA的乙睛溶液(B液)洗 脱,水相为含0.085%TFA的水溶液。手动收集各峰,脱盐、浓缩和干燥,一20 ℃冻存。 10.肿瘤特异性细胞毒性〔CTL)T淋巴细胞的体外诱导:取该志愿者负载不 同组分抗原肤的DC作为刺激细胞,在刺激细胞培养孔中加入自身外周血淋巴 细胞,于24h后,再加入等体积的含ZOU/m lth一IL一2继续培养,每3天换液1次。 每7天应用刺激细胞重复刺激淋巴细胞1次,共培养21天。 11.”c:释放试验检测cTL杀伤活性:Eca一109细胞为靶细胞,在4 xl护细 胞中加入100 p Ci Na25’CrO;,在室温中放置lh,不时摇动。用大量HankS液充 分洗涤细胞3次,除去游离铬,配成5 x10勺m1肿瘤细胞悬液。细胞以50:1效 靶细胞比加入96孔U一底培养板(200 pl/孔)培养4h。每个样品设置3个复孔, 收集培养上清,用Y计数仪检测上清CPM值。含有淋巴细胞、不负载抗原DC 和靶细胞的孔为对照孔。 结果: 郑州大学2004年博士学位论文 人食管癌Eca一109细胞膜肿瘤抗原筛选的研究 1.在pH 6.3的条件下,适当的去垢剂与膜蛋白之比(即mg去垢剂/mg膜蛋 白),在使用辛基p一葡糖昔时为6:1;使用肠妞。nX一100时为2:1。 2.Eea-log细胞的HLA的基因分型为A,03,A,24;B,35,B,37;n盼l’01, DRBI’12;DRB3。并找到一例表型为A03杂合子的健康志愿者。 3.PBMC的分化情况:健康人PBMC,只在IL一2维持下,用流式细胞仪检 测其分化情况。B细胞于第1周时基本死亡,第3周时完全消失;NK细胞于第 1周时明显增加,于第4周时


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