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《郑州大学》 2004年
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神经干细胞移植对脑外伤大鼠行为学影响的研究

李红伟  
【摘要】:颅脑创伤尤其重症损伤可引起多种神经、精神、行为等方面的损害,其中颅脑创伤后学习和记忆障碍对伤者的影响最为普遍和持久。尽管通过几代神经科学工作者的努力,这种令医学家们倍受困扰的局面始终没有解决。如何使损伤后神经系统得以修复,将其造成的后果和并发症减少到最低程度,是近年神经科学工作者努力研究的方向之一。神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)的发现和成功培养,给这种努力带来了新的希望。NSCs是一种具有自我更新能力的细胞,可增殖分化为中枢神经系统内的3种基本细胞:神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。通过植入NSCs,早期可分泌一些神经营养因子促进和支持内源性NSCs再生。后期通过自身细胞的增殖和分化来修复替代缺损的神经组织。本文通过对NSCs体外培养,扩增,并把体外荧光标记的NSCs植入脑创伤大鼠模型损伤区,移植后不同时间监测NSCs在脑内的生存、迁移、整合情况。并对植入脑内的NSCs长期观察,免疫组织化学监测分化情况。通过检测移植组大鼠行为学评分和学习记忆能力,并与对照组比较,评价NSCs移植治疗的作用。本实验可能为以后NSCs移植应用于临床来治疗脑创伤后学习与记忆障碍提供参考,NSCs大鼠脑内移植可对人类神经干细胞发育的生物学特点进行探讨。 方法:联合应用机械和免疫磁珠法分离人胚组织脑室区/脑室下区(Ventricular 郑州大学2的4届硕士研究生毕业论文 神经干细胞移植对脑外伤大鼠行为学影响的研究 zone/sub~tricular zone,vZ/svz)细胞,用无血清培养基对Nscs进行培养,Nestin 免疫组织化学鉴定NSCs。移植前以荧光标记物HoechS忍3258,标记NScs 30luln 后备用。采用自由落体撞击法制作大鼠脑创伤模型。城s枉叮大鼠90只,随机分为4 组,假损伤组(Sha.)、损伤组(扭I)、假移植组(TBI王Ns)每组各21只、移植组 (珊I+NScs)27只,4组大鼠分别于损伤后Zd及7d进行大鼠行为学评分;分别于 移植后Zd和7d处死移植组大鼠各2只制作脑组织冰冻切片,在荧光显微镜下观察 移植细胞存活及迁移状况:4组大鼠损伤后Zw处死各5只,制备脑组织切片行HE 染色,计数额顶叶皮层坏死神经元;4组大鼠分别于损伤后Zw和4w行Y迷宫试 验,检测学习和记忆能力。取移植后Zw和4w时大鼠脑组织切片行GEAP、NSE 免疫组化染色,观察移植细胞的分化情况。 结果:细胞培养8~10d后细胞生长成为数十个细胞到数百个细胞的悬浮球形 克隆,免疫组织化学Ne抓n鉴定阳性。移植后Zd冰冻切片在荧光显微镜下观察可见 标记NSCs发出蓝白色光,胞体及神经球边界清晰,形态完整,细胞沿针道两旁分 布,针道近旁较为密集,从针道向周围细胞分布逐渐稀疏。7d时观察可见部分完整 NSCs,针道近旁细胞分布较Zd时稀疏。NSCs移植2d后移植组与损伤组和假移植组 大鼠行为学评分之间(P0.05),NSCs移植后7d移植组与损伤组和假移植组大鼠行 为学评分,差异有显著性(尸0.05),移植后ZW和物,Y迷宫试验学习和记忆能力 评估显示,移植组与损伤组、假移植组之间差异有显著性(尸0.05)。Zw时HE染色 显示,损伤组在打击点下方额顶区可见胞浆粉红、核浓染、胞体皱缩的变性神经元。 对额顶叶皮层的神经元进行计数显示移植组比损伤组及假移植组坏死的神经元数 量为少护。.05)。脑组织免疫组化切片检测,NsE免疫组化结果:术后Zw,NSCs 移植侧脑组织切片可见NSE阳性细胞,胞浆丰富,呈团状分布。术后4w,仍可见 NSE阳性细胞。GEAP免疫组化结果:术后Zw,NsCs移植侧脑组织切片可见G凡J 阳性细胞,细胞呈团状或散在分布,圆形或梭形,细胞突起较少或无;在术后4w, 郑州大学2004届硕士研究生毕业论文 神经干细胞移植对脑外伤大鼠行为学影响的研究 G碑印阳性细胞长出许多突起,形态与正常形态接近。其余三组大鼠脑切片免疫组 化染色GFAP、NSE均为阴性。 结论:①采用机械和免疫磁珠法分离胚胎脑组织特定区域中的细胞,用无血 清培养基培养,细胞生长状态良好,免疫组化鉴定为NSCS。②Hoechst33258标记的 NSCs植入大鼠脑创伤模型脑内后能够存活,向损伤区迁移并与宿主脑组织融合在 一起。③NSCs移植治疗脑创伤大鼠可明显提高大鼠行为学评分及学习记忆能力。 ④植入的NSCs能够保护受损后的脑组织,减少神经元坏死,并在大鼠脑内可分化 为神经元和神经胶质细胞,修复缺失的神经组织。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R651

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