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《郑州大学》 2007年
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血红素加氧酶-1在NaAsO_2诱导Eca-9706细胞凋亡中的作用研究

马会敏  
【摘要】: 食管癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤,通常治疗困难,预后不佳。探索杀伤食管癌细胞更有效的途径是医学研究工作者努力的方向之一。研究发现亚砷酸钠(NaAsO_2)能够刺激肿瘤细胞内活性氧水平升高,将细胞周期阻滞于G_2/M期,进而诱导肿瘤细胞凋亡,是一种有效的抗肿瘤药物。血红素加氧酶-1(HO-1)是哺乳动物细胞中广泛存在的一种可诱导酶,具有抗炎,抗凋亡等效应,与肿瘤的发生发展有很大关系。国际上已有众多研究关注了HO-1在肿瘤的防治方面的作用,发现肿瘤细胞内HO-1表达普遍升高;干预肿瘤细胞内HO-1表达可以影响肿瘤的生长,且可影响肿瘤细胞对化学疗法或放射疗法的敏感性,为肿瘤的放化疗提供辅助作用。但是对于HO-1在食管癌的治疗中的作用研究,国内外尚未见报道。因此本实验旨在探讨干预肿瘤细胞内HO-1的表达是否能够增加细胞对化疗药物的敏感性,希望为临床治疗食管癌探索一条新的有效途径。 第一节HO-1基因真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1的构建及表达 目的:构建人HO-1真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1并检测其表达。 方法:用HindⅢ和BamHI双酶切含有目的基因hHO-1的质粒pGEM-TEasy-hHO-1及质粒pcDNA3.1,将切下的hHO-1基因与质粒pcDNA3.1连接,构成重组质粒;鉴定HO-1基因插入成功后,转染人食管癌Eca-9706细胞,提取细胞总RNA及细胞总蛋白质,用RT-PCR及Western blotting方法检测重组载体在细胞内的表达情况,最终确定重组载体是否构建成功。 结果:HindⅢ和BamHI双酶切鉴定说明hHO-1成功克隆入表达载体pcDNA3.1中。基因转染24h后提取总RNA,经RT-PCR检测显示转染重组质粒组HO-1 mRNA表达显著升高,是对照组的9倍以上;提取总蛋白质经Western blotting检测显示在32KD处有特异蛋白表达,转染重组质粒组HO-1蛋白表达量明显高于对照组。 结论:本部分实验成功构建了能够在细胞内大量表达HO-1基因产物的真核表达载体pcDNA3.1—hHO-1。 第二节NaAsO_2诱导Eca-9706细胞凋亡及HO-1表达 目的:研究NaAsO_2对Eca-9706细胞的诱导凋亡作用及在此过程中HO-1的表达变化。 方法:用不同浓度NaAsO_2作用于Eca-9706细胞,MTT法检测Eca-9706细胞对NaAsO_2的敏感性;MTT法检测NaAsO_2对Eca-9706细胞生长的影响;镜下观察加药后不同时间点细胞形态变化;DNA ladder检测药物处理后凋亡的发生;流式细胞仪检测细胞的凋亡情况;同时用RT-PCR方法检测在NaAsO_2诱导Eca-9706细胞凋亡过程中不同时间点HO-1mRNA表达变化。 结果:低浓度(2.5μmol/L以下)NaAsO_2作用于Eca-9706细胞,对Eca-9706细胞生长无抑制作用,反而有微弱促进生长作用,不能诱导细胞凋亡,对细胞无杀伤作用。中等以上浓度(15μmol/L以上)的NaAsO_2作用于Eca-9706,对细胞生长有抑制作用并随NaAsO_2浓度升高抑制作用增加;15μmol/L以上浓度NaAsO_2作用于Eca-9706细胞16h可出现凋亡特征性的DNA ladder,流式细胞仪检测有凋亡发生,凋亡率随药物浓度而升高。RT-PCR结果显示在NaAsO_2作用于Eca-9706细胞4h,已检测到HO-1表达升高,8h升至最高,以后表达水平迅速下降,至16h已下降到接近正常水平。 结论:15μmol/L以上浓度NaAsO_2能够诱导Eca-9706细胞凋亡,在此过程中HO-1表达短暂升高,可能是细胞对抗NaAsO_2凋亡作用的一种保护反应。 第三节HO-1的表达对NaAsO_2诱导Eca-9706细胞凋亡的影响 目的:研究细胞内HO-1表达变化能否改变NaAsO_2对Eca-9706细胞的诱导凋亡效应,从而通过诱导或抑制HO-1表达,改变肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。 方法:重组质粒pcDNA3.1-hHO-1转染Eca-9706细胞或40μmol/L heme诱导HO-1表达,20μmol/L SnPPIX抑制HO-1表达;MTT法检测HO-1表达变化对NaAsO_2的细胞毒性作用的影响;DNA ladder,流式细胞仪检测HO-1表达对NaAsO_2诱导Eca-9706细胞凋亡的影响。 结果:转染重组质粒pcDNA3.1-hHO-1或用40μmol/L heme诱导HO-1表达后,降低了细胞对NahsO_2的敏感性,使IC_(50)升高;15μmol/L NaAsO_2作用下没有凋亡细胞典型的DNA ladder出现;流式细胞仪结果显示,在15μmol/L NaAsO_2作用下细胞凋亡率显著下降。而使用20μmol/L SnPPIX抑制细胞内HO-1表达,则可增加细胞对NaAsO_2的敏感性,IC_(50)降低;较低浓度即可出现凋亡细胞典型的DNA ladder,流式细胞仪结果显示在15μmol/L NaAsO_2作用下细胞凋亡率显著升高。 结论:用20μmol/L SnPPIX抑制细胞内HO-1表达,可增加Eca-9706细胞对NaAsO_2的敏感性,增强NaAsO_2对Eca-9706细胞的诱导凋亡作用。因此使用抑制剂SnPPIX抑制细胞内HO-1表达可增加Eca-9706细胞对NaAsO_2诱导凋亡效应,使较小的药物剂量即可达到较好的诱导效果,起到化疗增敏剂的作用,为临床治疗食管癌提供了一条新的有效途径。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q255

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