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《郑州大学》 2007年
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胃泌素-shRNA表达载体的构建及其对胃癌细胞系BGC-823的效应

夏彬  
【摘要】: 胃癌是世界上最常见致死性疾病之一。虽然在一些国家,其发病率与致死率有所下降,但从全球范围看其发病率依然居高不下。胃泌素是一种多肽激素,主要由胃肠道G细胞分泌,具有刺激胃酸分泌和对胃肠粘膜的营养作用。在胃癌细胞系BGC-823中,胃泌素被证明是胃癌细胞的生长因子。研究发现,胃泌素能增强BGC-823细胞系的运动,有促进肿瘤细胞转移的作用。此外,胃泌素通过其受体介导细胞内信号传导,使细胞山G_0/G_1期向S、G_2/M期转化,促进细胞的增殖,抑制细胞凋亡。因此,胃泌素基因有可能作为胃癌基因治疗的一个有效的靶基因。 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是生物体内的一种通过双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)来抵抗病毒入侵和抑制转座子活动的自然机制。细胞内双链RNA在酶的作用下,形成20-25碱基大小的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNAs),siRNAs结合多组分核酸酶并使其激活,从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA,抑制该基因在细胞内的翻译表达。RNAi已被成功用来抑制多种生物的基因表达,更为引人注目的是,其可以作为治疗肿瘤的新手段。RNAi技术已广泛被用于白血病、大肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌等多种人类肿瘤的研究,但应用其研究胃癌近年才有报道。由于人工合成siRNA的时效性限制,构建shRNA表达载体,建立相应基因抑制的细胞系成为目前该研究领域的趋势。 在以往研究的基础上,本研究构建了胃泌素-shRNA表达载体。该载体带有neo抗性基因和绿色萤光蛋白基因。转染BGC-823细胞后,以绿色萤光蛋白的表达检测转染效率,以G418进行筛选,建立了胃泌素-shRNA表达载体稳定转染的胃癌细胞系。应用RT-PCR验证胃泌素在mRNA水平的抑制效应。通过流式细胞(Flow Cytometry,FCM)和MTT技术检测胃泌素-shRNA表达载体对BGC-823细胞的效应,为进一步深入研究胃泌素在胃癌发生作用的分子机制提供实验基础。 材料与方法 1.改建质粒pSUPER-EGFP-NRG由于质粒pSUPER-EGFP-NRG中BglⅡ酶切位点被破坏,无法插入外源DNA片段,因此首先对质粒pSUPER-EGFP-NRG进行改建。改建的载体含有BglⅡ酶切位点,不含有NRG编码序列。根据质粒pSUPER-EGFP-NRG的序列,设计一对引物(其中含有BglⅡ酶切位点),以质粒pSUPER-EGFP-NRG为模板,进行PCR。将回收的PCR产物克隆至pSUPER-EGFP-NRG中,构建重组体pSUPER-EGFP-I,酶切及测序鉴定。 2.构建胃泌素-shRNA真核表达载体设计并合成一对编码胃泌素-shRNA的互补寡核苷酸片段,退火成双链,产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。将其克隆至pSUPER-EGFP-I中,构建胃泌素-shRNA真核表达载体pSUPER-EGFP-G,酶切及测序鉴定。 3.细胞培养及转染胃癌BGC-823细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,加入浓度分别为100u/ml和100μg/ml的青霉素和链霉素。转染BGC-823细胞前,改用双无RPMI-1640培养基。用无内毒素质粒提取试剂盒抽提pSUPER-EGFP-G与pSUPER-EGFP-I。BGC-823细胞随机分为实验组、实验对照组和空白对照组,用Lipofectamine~(TM) 2000转染试剂将pSUPER-EGFP-G转染入实验组,pSUPER-EGFP-I转染入实验对照组,空白对照组仅含脂质体Lipofectamine~(TM) 2000。 4.筛选与扩增转染后的细胞铺满培养板后,按1:5的密度比传代至新的培养板。在含400μg/ml G418的RPMI-1640选择性培养基中筛选,每3d换一次培养基。约两周后,阳性细胞克隆形成,将单克隆细胞跳入24孔板,继续培养。细胞铺满培养板后,移入培养瓶继续培养。 5.胃泌素-shRNA表达载体对胃癌细胞BGC-823的效应应用RT-PCR技术检测胃泌素mRNA的抑制水平;应用MTT法和流式细胞技术检测细胞增值和细胞周期的改变。 6.统计学处理应用SPSS10.0统计软件对数据进行统计学处理,数值用(?)±s表示。应用单因素方差分析进行组间差异比较,以α=0.05为检验水准。 结果 1.胃泌素-shRNA真核表达载体的构建对pSUPER-EGFP-G进行酶切和序列分析,酶切图谱及插入序列与预期结果一致。 2.RT-PCR结果胃泌素和β-actin扩增的片段分别为207bp和300bp,3组细胞扩增条带灰度比值(胃泌素/β-actin)的均值分别为:空白对照组,1.09±0.011;实验对照组,1.074±0.016;实验组,0.155±0.012。实验组比值较空白对照组有显著差别(P<0.01)。实验对照组与空白对照组无显著性差异(P>0.05)。结果表明胃泌素-shRNA表达载体可有效抑制胃癌细胞系BGC-823中胃泌素基因的表达。 3.MTT结果3组细胞存活率分别为空白对照组,0.988±0.042;实验对照组,0.958±0.033;实验组,0.734±0.026。实验组与空白对照组比较,其细胞增殖能力明显下降(q=15.426,P<0.05)。结果表明胃泌素-shRNA表达载体可有效抑制胃癌细胞系BGC-823的增值。 4.流式细胞实验结果实验组的BGC-823细胞,G_0~G_1期细胞由空白对照组的59.5%上升至62.7%,G_1/M期细胞由空白对照组的10.1%上升为17.9%,而S期细胞由30.4%下降至19.4%。 结论 1成功构建了胃泌素-shRNA真核表达载体pSUPER-EGFP-G。 2成功建立了胃泌素表达敲低(knock down)的胃癌细胞系。 3通过沉默胃泌素基因,胃泌素-shRNA表达载体可有效抑制胃癌细胞系BGC-823的增值。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R735.2

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