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《郑州大学》 2007年
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苯甲酸雌二醇对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用研究

李军  
【摘要】: 缺血性脑血管病(ischemia cerebrolvascular disease,ICVD)具有发病率高、死亡率高、致残率高的特点,是目前严重危害人类健康的主要疾病之一,随着我国老龄化人口的增加,缺血性脑血管病发病率在不断提高。缺血性脑血管病的神经损伤及细胞死亡机制一直是基础和临床医学研究的热点。 缺血性脑损伤的细胞死亡方式有两种:坏死和凋亡。细胞凋亡主要发生在缺血灶周围,参与了脑缺血再灌注损伤,并可能和缺血灶的扩大有关,在缺血性脑损伤中占据重要地位。脑缺血后细胞凋亡的发生既是凋亡相关基因表达的结果,又受许多内外因素的调节,如细胞内钙超载、氧自由基、兴奋性氨基酸、NO、炎症介质等。近来炎症介质和脑缺血再灌注后细胞凋亡的关系日益受到人们的重视,众多学者纷纷寻求拮抗脑缺血再灌注后炎性损伤机制的核心靶点。近年发现,核因子-κB(nuclear factor-κappaB,NF-κB)与炎症反应密切相关。核因子-κB是一种能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子κB序列特异结合的蛋白因子,广泛存在于中枢神经系统。在哺乳动物细胞中,NF-κB/Rel家族成员主要有5个,即RelA(p65)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p50/p105)、NF-κB 2(p52/p100),其中p65含有转录活化区域,利用其C末端的反式激活域增强靶基因的转录表达,在细胞中最普遍,含量最丰富,它常被人们选做研究NF-κB转录激活功能的主要目标。NF-κB可直接调控参与脑缺血再灌注后炎性损伤的多种介质的表达,如肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor-a,TNF-a)、白细胞介素(interleukin,IL)、细胞粘附分子(cellular adhesion molecule,ICAM-1)、血管细胞间粘附分子(vessel cellular adhesion molecule,VCAM-1)、诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)等,因而NF-κB活化被认为是介导或加剧脑缺血再灌注后炎性损伤的中心环节。 研究表明,一氧化氮(NO)是一种兼有细胞内和细胞间信使和神经递质的气体物质,在脑缺血再灌注损伤中具有神经保护和神经毒性的双重作用:低浓度NO起着生理信息的传递作用,高浓度NO则具有极强的神经毒性作用。脑缺血后NO可通过脱氨基作用和抑制核糖核酸还原酶(DNA合成的限速酶),导致DNA结构破坏,复制与修复的抑制,而DNA的损伤又可激活多聚合酶而减少细胞基质与ATP,快速消耗能量产生神经毒性,引起神经细胞凋亡。研究显示,NO在脑缺血早期释放量少,亚急性期明显增加,而诱导型一氧化氮合酶是介导此期NO合成的主要限速酶。iNOS为非钙离子/钙调蛋白依赖性酶,在生理下并不表达,在病理状态下,如发生炎症时,在脂多糖(LPS)或某些细胞因子的刺激下,可在多种神经细胞中诱导表达。iNOS一旦诱导合成即可持续产生大量NO,直至底物耗尽;而且iNOS mRNA半衰期特别长,可持续长时间翻译合成iNOS。基于以上特点,iNOS是脑缺血后NO过量产生的主要来源。 雌激素是一种甾体激素,雌二醇(β-estradiol,βE_2)是雌激素的主要成分,其生物学效能最强。据流行病学调查研究表明,绝经前女性较同龄男性的脑卒中发病率低,而绝经后女性的脑卒中发病率明显增高。临床上使用雌激素替代疗法可使发生卒中的相对危险度下降,与卒中有关的死亡率亦下降,然而雌激素对脑缺血的影响机制迄今仍不十分清楚,雌激素对脑缺血再灌注后NF-κB和iNOS表达与细胞凋亡影响的报道甚少。本实验用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,观察大鼠脑缺血再灌注损伤后缺血灶周围NF-κB p65和iNOS表达与细胞凋亡的变化及苯甲酸雌二醇的影响,探讨局灶性脑缺血再灌注损伤的机制及雌激素的脑保护作用机制,为临床治疗缺血性脑血管病提供理论依据。 材料与方法 1试验动物与分组:健康成年雄性SD大鼠24只,体重260~300g,随机分为:假手术组、对照组(缺血2h/再灌注24h组)、雌激素组(缺血2h/再灌注24h+苯甲酸雌二醇),每组8只; 2给药方法:雌激素组:用苯甲酸雌二醇(上海通用药业股份公司,规格:每支2mg/1ml)按0.1ml/kg(200μg/kg)腹腔注射给药,每日1次,连续7天。假手术组和对照组给予等量生理盐水; 3模型建立:给药7天后采用改良的Longa线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,假手术组不插线。术后观察同侧Horner氏征和对侧肢体瘫痪体征以判断模型是否成功; 4标本制备:各组于麻醉清醒后先进行神经功能缺损评分。缺血2小时拔出线栓再灌注24小时再次麻醉,心脏灌注,多聚甲醛固定后断头取脑做石蜡切片,供HE染色、免疫组化及检测凋亡细胞用; 5观测指标: (1)神经功能缺损评分:比较各组神经功能缺损情况; (2)HE染色:在显微镜下观察脑组织病理学变化; (3)免疫组化:观察各组脑缺血再灌注后NF-κB p65和iNOS表达情况; (4)TUNEL染色; 6免疫组化和TUNEL染色结果判定:免疫阳性细胞被染成棕黄色,iNOS阳性细胞为胞浆着色;NF-κB p65阳性细胞的胞核和胞浆内光镜下可见棕黄色物质。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性凋亡细胞。每张切片在缺血灶周围随机计数6个高倍镜视野(400×)中的阳性细胞数,取平均值,分别作为NF-κB p65、iNOS、TUNEL阳性细胞数; 7统计方法:应用SPSS10.0统计软件进行数据处理,实验数据用均数±标准差((?)±s)表示。先进行正态分布和方差齐性检验,符合正态分布和方差齐后,两组均数间比较采用t检验,多组均数间比较采用单因素方差分析。以a=0.05作为检验水准。 结果 (1)对照组和雌激素组术后出现左侧Horner氏征,右侧肢体瘫痪,以前肢为重,提尾见大鼠右前肢屈曲、内收。假手术组仅出左侧Horner氏征。说明模型复制成功; (2)各组大鼠神经功能缺损评分:假手术组:0;对照组:2.25±0.46;雌激素组:1.63±0.52。雌激素组神经功能缺损评分明显低于模型组(P<0.05),说明苯甲酸雌二醇能够能够减轻大鼠脑缺血再灌注后神经功能缺损; (3)HE染色:脑组织切片HE染色:假手术组无梗死灶。对照组有明显的梗死灶,光镜下可见大量深染的神经元细胞核,核固缩、偏位、致密,胞浆嗜酸性增加;坏死中心区可见神经细胞坏死,神经元外形不易辨认,大部分细胞结构消失,胞浆空泡样变性,坏死灶内大量胶质细胞增生。坏死边缘区可见细胞核固缩明显,核深染,胞浆嗜酸性明显增多。雌激素组梗死灶不明显,多数神经元结构较完整,形态相对正常,间质水肿轻。说明苯甲酸雌二醇能够改善大鼠缺血再灌注后脑组织的病理变化,对脑缺血再灌注损伤有保护作用; (4)NF-κB p65表达情况:各组NF-κB p65阳性细胞数:假手术组为2.25±0.64;对照组为32.08±4.32;雌激素组为23.73±4.16。和假手术组比较,对照组NF-κB表达明显增加(P<0.01);而雌激素组NF-κB表达较对照组明显减少(P<0.01)。说明大鼠脑缺血再灌注后NF-κB表达增加,而雌激素能够抑制大鼠脑缺血再灌注后NF-κB的表达; (5)iNOS表达情况:各组.iNOS阳性细胞数:假手术组为2.15±0.69;对照组为26.34±3.73;雌激素组为17.85±3.07。和假手术组比较,对照组iNOS表达明显增加(P<0.01);而雌激素组iNOS表达较对照组明显减少(P<0.01)。说明大鼠脑缺血再灌注后iNOS表达增加,而苯甲酸雌二醇能够抑制大鼠脑缺血再灌注后iNOS的表达; (6)TUNEL染色:假手术组未见凋亡细胞;对照组凋亡细胞数为38.58±4.05;雌激素组为28.34±3.33。雌激素组与对照组比较凋亡细胞明显减少(P<0.05)。说明大鼠脑缺血再灌注后凋亡细胞增多,雌激素能够减少脑缺血再灌注细胞凋亡的发生。 结论 (1)NF-κB和iNOS参与了脑缺血再灌注损伤的病理生理过程; (2)苯甲酸雌二醇能够减轻大鼠脑缺血再灌注后神经功能缺损和脑组织病理结构损伤,其机制可能是通过抑制脑缺血再灌注后NF-κB和iNOS的表达,有效减少细胞凋亡实现的。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R743.3

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9 侯伟;大鼠正畸牙移动过程中eNOS和iNOS的表达[D];南京医科大学;2011年
10 刘清芳;青黛颗粒对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜MUC2和iNOS基因表达的影响[D];中国医科大学;2010年
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