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《郑州大学》 2007年
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低能离子束注入松科花粉的细胞学效应研究

李国平  
【摘要】: 离子束生物工程学作为一门新兴的交叉学科,目前仍然有技术问题值得进一步研究,特别是关于低能离子束注入后对植物细胞的直接损伤效应方面的知识还很缺乏。在离子注入试验中植物的休眠种子是最常用的试验材料。许多研究报道描述了受处理种子萌发以后,如幼苗或成长的植物体上的生物学效应,其研究结果也只是在个体水平描述离子束诱发的生物学效应;很多研究采用裸露的生物有机分子作为注入对象研究离子束对生物分子的直接作用,但以生物大分子系统模拟实验的结果只能对离子束的作用机制进行推测性解释,不能用于说明生活的细胞中的变化。细胞是生物体的结构和功能单位。离子束作用于生物体的有效部位也是细胞。细胞学效应是辐射生物学效应中最显著的效应之一。因此,只有在细胞水平探索离子束与细胞的直接相互作用,深入研究离子束对细胞的“加工”效应,才能在真正意义上揭示离子束生物学效应机理。 要阐明低能离子束的细胞学效应机制,需要找到一个良好的实验模式系统。花粉接近单细胞,结构相对简单,可以离体培养,且可以在短时间内完成观测,是研究辐射生物学效应机理较理想的实验系统。由于裸子植物花粉具有生命力强、耐贮藏和花粉量大等优点,本研究选择裸子植物黑松(Pinus thunbergiiParl.)和雪松[Cedrus deodara(Roxb.)G.Don]花粉作为离子注入对象,以能量为30keV、剂量为1~5×10~(15)ions/cm~2的氮离子为离子源,从花粉细胞壁、细胞膜、细胞骨架系统、细胞核和蛋白质组等几个结构层次研究低能离子束注入对细胞的直接损伤效应。本项研究所获得的研究结果主要包括如下6个方面。 1.应用生物显微镜技术,观察了低能离子注入对花粉萌发和花粉管生长的影响。对花粉萌发和花粉管生长有显著影响的起始剂量是3×10~(15)ions/cm~2。剂量为3~5×10~(15)ions/cm~2的N离子注入显著促进雪松花粉的萌发,其剂量-效应曲线呈先升后降;而离子注入总体上抑制黑松花粉的萌发,其剂量-效应曲线呈“马鞍型”,“鞍点”出现在7×10~(15)ions/cm~2。从花粉管生长速率和花粉管畸形情况看,离子注入对雪松和黑松花粉管的损伤效应很相似。总体上,离子注入抑制花粉管的生长,并引起花粉管发生畸形,畸形花粉管的主要类型是花粉管变宽和(或)花粉管顶端肿胀。通过低能离子、紫外线和伽马射线辐照花粉的比较研究,认为不同辐照源对花粉有不同的损伤机制。 2.首次应用原子力显微镜,结合普通光学显微镜、扫描电子显微镜从不同的尺度水平研究了低能离子注入对雪松花粉外壁结构的影响。普通光学显微镜观察表明,注入剂量≥7×10~(15)ions/cm~2时,花粉着色与对照有显著的差异,表现在花粉表面呈锈色;原子力显微镜和扫描电子显微镜图像显示低能离子注入对雪松花粉壁有刻蚀作用,主要表现在花粉外壁结构单位被削去;刻蚀程度与注入剂量呈正相关,注入剂量3×10~(15)ions/cm~2开始对花粉外壁有刻蚀作用,剂量≥5×10~(15)ions/cm~2时,花粉壁表面开始出现“孔”、“洞”结构,甚至出现较大的裂痕或“沟”。这些研究结果为离子束介导外源基因进入受体的遗传转化技术提供了实验证据。 3.为探讨离子注入损伤细胞的生理机制,以黑松花粉为材料,研究低能离子注入处理后花粉内超氧阴离子自由基(O_2~(·-))产生速率、丙二醛(MDA)含量、细胞膜相对透性(伤害度)和抗氧化酶SOD、POD、CAT活性动态变化。研究结果表明,当注入剂量≥3×10~(15)ions/cm~2时,花粉内超氧阴离子自由基(O_2~(·-))含量极显著提高,使膜脂过氧化作用增强,导致膜系统损伤,花粉MDA含量显著提高,细胞膜相对透性增大,三个指标之间呈正相关;在低注入剂量1×10~(15)ions/cm~2下,花粉超氧化物歧化酶(SOD)活性提高,但随着注入剂量的增加,SOD活性逐渐降低;而过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性随着注入剂量的增加而下降。由此推测,在黑松花粉中抵御离子注入所产生的自由基的抗氧化酶类可能是超氧化物歧化酶(SOD)。 4.为从蛋白质分子水平揭示低能离子注入对细胞的损伤效应,应用SDS-PAGE电泳技术和PAGE电泳技术分析了低能离子注入黑松花粉后花粉管内蛋白质组成及SOD同工酶、POD同工酶谱带的变化。研究结果表明,离子注入可引起细胞内蛋白质组成和同工酶谱发生改变,这说明离子注入后可以使花粉粒内的遗传物质表达发生了一定的变化。 5.细胞骨架与细胞功能的密切相关。正常微管、微丝骨架结构在花粉管的顶端生长过程中具重要作用。裸子植物花粉管骨架系统的结构与功能有别于被子植物的。应用免疫荧光标记法和荧光染色法,结合激光扫描共聚焦显微镜术,观察了低能离子注入处理对黑松花粉和花粉管中微管、微丝骨架系统的影响。研究结果表明,离子注入花粉后,花粉管内骨架系统结构会受到不同程度的破坏。花粉管内微管骨架的破坏与离子注入所引起的花粉管形态异常(特别是花粉管顶端肿胀现象)有关,认为是离子注入引起花粉管(特别是其顶端)微管骨架的破坏,从而诱发花粉管形态异常,特别是花粉管顶端肿胀;此现象与秋水仙素所诱发的花粉管形态显著异常现象相似;花粉管内微丝骨架的破坏与离子注入抑制花粉管生长呈正相关,认为是离子注入引起花粉管内微丝骨架结构的破坏,从而导致花粉管生长迟缓。 6.应用激光扫描共聚焦显微镜术观察了低能离子注入对黑松花粉粒内细胞核的直接损伤效应,研究结果首次揭示了低能氮离子注入可直接损伤细胞核结构,导致细胞核裂解,统计分析表明细胞核损伤程度与注入离子剂量密切相关。单细胞凝胶电泳,即彗星试验,是一种测定和研究单个细胞DNA链断裂的新电泳技术。本研究首次应用碱性单细胞凝胶电泳技术在体检测低能离子注入花粉后细胞DNA分子的直接损伤效应,结果表明:低能离子注入处理引起细胞核DNA单链断裂,细胞核DNA分子的损伤程度随着剂量的提高而增加,揭示了离子注入可诱发细胞核DNA突变。 本研究以花粉和花粉管作为一个模式系统,在细胞或亚细胞水平初步研究了低能离子束注入对花粉细胞的直接损伤效应机制,认为低能离子注入对花粉细胞壁有刻蚀作用,破坏正常的膜系统结构和微管、微丝骨架系统,造成细胞核结构损伤和DNA分子断裂,引起酶和蛋白质的组成或结构改变;离子注入对细胞的损伤是直接的,也可能通过自由基的积累间接地对细胞造成结构和生理损伤;细胞骨架系统是注入离子攻击的关键“靶”,微管和微丝骨架系统损伤与许多后续的细胞学效应有关;离子注入对细胞骨架系统的破坏是离子注入诱发细胞损伤效应的重要机制之一。然而,离子束注入损伤细胞的机制相当复杂,许多问题有待于进一步研究,特别是应该深入分析离子注入细胞后DNA和蛋白质等生物大分子变化。本研究结果仅为进一步研究离子束生物学效应的细胞学机理提供了一些实验性基础资料。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q947

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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7 郭爱;蓝果忍冬(Lonicera caerulea L.)开花结实特性及授粉受精的研究[D];东北农业大学;2009年
8 王宏;细胞外钙调素对雪松花粉萌发和花粉管生长的影响[D];山东师范大学;2004年
9 钱时权;合成PHA相关基因离子束诱变及其高产突变体分子机制研究[D];安徽农业大学;2007年
10 王新绘;氮离子注入对彩棉的诱变效应研究[D];新疆大学;2004年
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